microRNA-22對調控軟骨細胞自噬的影響及其在骨關節炎發病中的作用機制

顏世舉，董文靜，李志銳，趙燕鵬，韓 濤，魏均強，王俊良，林 峰

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種最常見的關節退行性疾病[1]，其病情進展與年齡呈正相關。中老年人發病率較高[2]，對生活質量產生嚴重影響，且是致畸致殘的重要因素[3]。細胞自噬(autophagy)是真核細胞中廣泛存在的分解再利用系統，具有高度保守性[4]。自噬通過清除、降解受損細胞器或功能失調的大分子，以維持細胞內環境穩態，高效利用營養物質，促進細胞生存[5]。研究表明，自噬對于維持軟骨組織新陳代謝的平衡具有重要作用，軟骨細胞自噬水平降低是OA的重要病理變化標志之一，并參與了OA的發生與發展[6]。

microRNA即微小RNA，是一類高度保守的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物細胞內[7]。microRNA不參加基因的轉錄和翻譯過程，可與下游目標靶基因mRNA 中3′端非編碼區(3′-UTR)特異性結合，分解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA蛋白翻譯過程，起到基因沉默的作用[8]。目前關于OA相關特異性microRNA及其靶基因調控網絡已有報道[9, 10]，同時研究表明，microRNA-22在OA軟骨組織、關節液中異常高表達[11, 12]，但其具體作用機制尚不十分清楚。因此本研究聚焦microRNA-22對軟骨細胞自噬的影響，進而探討其在OA發病中的作用，為臨床診斷及治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1 實驗細胞 OA軟骨組織取自解放軍總醫院海南醫院骨科因重度OA行人工膝關節置換術患者術中膝關節軟骨，共14例。健康軟骨組織取自外傷行截肢術患者術中膝關節軟骨，共12例。每例軟骨標本均獲得患者完全知情同意。

1.2 試劑及儀器 Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶(Millipore，美國)，Taqman微小RNA逆轉錄試劑盒、Taqman MicroRNA assays(Applied Biosystems，美國)，Lipofectamine 2000 (Life technologies, 美國)，miR-22模擬物、抑制物(廣州銳博)，LC3B抗體、Collagen Ⅱ(COL2A1)抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Tech，美國)，結晶紫(南京凱基)。

1.3 人軟骨細胞獲取與培養 無菌條件下獲取人軟骨組織，去除滑膜、結締組織等雜質，在超凈臺中切碎至1 mm3大小顆粒，PBS沖洗后0.25%胰蛋白酶于37 ℃培養箱消化30 min，PBS沖洗后加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃恒溫搖床中緩慢搖動孵育12 h，濾網過濾后，PBS沖洗，1000 r/min，離心5 min，棄去上清，以含10%胎牛血清的DMEM完全培養液混勻，將軟骨細胞以2×105/ml接種于培養瓶中，置于5%CO2飽和濕度、37 ℃恒溫細胞培養箱內培養。每48 h更換培養液1次，同時觀察原代軟骨細胞生長狀態。待軟骨細胞生長至融合度80%時按1∶3傳代培養。

1.4 熒光定量PCR microRNA-22在健康、OA軟骨細胞中的表達水平 待健康軟骨細胞、OA軟骨細胞處于對數生長期，使用Trizol裂解液從軟骨細胞中提取總mRNA。取1 μg總RNA，使用Taqman微小RNA反轉錄試劑盒進行反轉錄，Taqman MicroRNA assays試劑盒進行熒光定量PCR反應。擴增程序設置：(1)Tap酶激活：95 ℃，10 min；(2)擴增反應：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。以小核RNA U6為管家基因，采用2-△△Ct法計算microRNA-22在正常軟骨細胞、OA軟骨細胞中的相對表達水平。

1.5 Western blot檢測健康、OA軟骨細胞中自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ的表達及其比值LC3B-Ⅱ/Ⅰ 待健康軟骨細胞、OA軟骨細胞處于對數生長期、生長狀態良好時，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解軟骨細胞，獲取總蛋白；配制SDS-PAGE蛋白凝膠，取等量蛋白，上樣，設置恒壓80 V電泳蛋白樣品；設置恒壓100 V、90 min轉膜，使用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉90 min，并與LC3B一抗、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗，與辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫下孵育1 h，TBST清洗，加入顯色底物;采用Image J圖像分析軟件，獲取、分析各組條帶灰度值，進行統計學處理。

1.6 平板克隆形成實驗microRNA-22對軟骨細胞活性的影響 將軟骨細胞分為空白組、miR-22模擬物組、miR-22抑制物組，待細胞進入對數生長期時，進行Lipofectamine 2000細胞轉染，三組軟骨細胞分別轉染miR-22陰性對照、模擬物、抑制物序列，轉染序列終濃度為100 nM。轉染12 h后棄去轉染體系，更換為10% FBS完全培養液，繼續恒溫細胞孵箱內培養48 h后，胰蛋白消化、收集細胞，將三組細胞接種在6孔板中，300個/孔，使用10% FBS完全培養液繼續培養。14 d后，室溫下甲醇固定20 min，PBS清洗后以結晶紫染液室溫下染色20 min，顯微鏡下拍照，并計數細胞克隆數。實驗重復4次。

1.7 Western blot檢測microRNA-22對軟骨細胞自噬的影響 將軟骨細胞分為空白組、miR-22模擬物組、miR-22抑制物組，采用上述轉染方法轉染三組軟骨細胞，轉染12 h后棄去轉染體系，更換為10% FBS完全培養液，繼續恒溫細胞孵箱內培養48 h后，胰蛋白消化、收集細胞，將三組細胞接種在6孔板中，1×105個/孔，待軟骨細胞進入對數生長期時，棄去培養液，PBS緩沖液輕輕清洗2次，提取細胞總蛋白，Western blot檢測軟骨細胞LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Collagen Ⅱ的表達水平，方法同前所述。

2結 果

2.1 microRNA-22在健康、OA軟骨細胞中的表達水平 熒光定量PCR檢測結果顯示，OA軟骨細胞中microRNA-22表達含量(2.50±0.39)顯著增高，約為健康軟骨細胞(0.98±0.25)的2.5倍，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 健康、OA軟骨細胞中自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ的表達 Western blot檢測結果顯示，與健康軟骨細胞相比，OA軟骨細胞自噬相關蛋白LC3B的Ⅱ類亞型含量顯著降低(圖1)；OA軟骨細胞(4例)LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值為1.25±0.13，健康軟骨細胞(4例)LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值為1.85±0.21，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖1 骨關節炎自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、Ⅰ在健康、

2.3 microRNA-22對軟骨細胞克隆形成能力的影響 平板克隆形成實驗檢測結果顯示：與空白對照組(107.33±14.3)相比，軟骨細胞轉染miR-22模擬物后，細胞克隆形成數量(75.67±11.36)顯著降低(P<0.01)；與空白對照組相比，軟骨細胞轉染miR-22抑制物后，細胞克隆形成數量(128.5±9.95)顯著增高(P<0.05，圖2)。

圖2 骨關節炎microRNA-22對軟骨細胞克隆形成能力的影響

2.4 microRNA-22對軟骨細胞自噬及OA發生發展的影響 Western blot檢測結果顯示：與空白對照組細胞相比，miR-22模擬物組軟骨細胞中LC3B-Ⅱ含量顯著降低，LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值降低，Ⅱ型膠原Collagen Ⅱ的表達水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-22抑制物組軟骨細胞中LC3B-Ⅱ含量顯著增高，LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值增高，同時Ⅱ型膠原Collagen Ⅱ的表達水平增高，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 骨關節炎microRNA-22對軟骨細胞自噬的影響

表1 骨關節炎microRNA-22對軟骨細胞自噬的影響

注：與空白對照組相比，①P<0.05

組別LC3B-ⅠLC3B-ⅡLC3B-Ⅱ/ LC3B-ⅠCollagen Ⅱ空白對照組1.01±0.031.92±0.111.90±0.140.98±0.09miR-22模擬物組1.03±0.081.50±0.20①1.45±0.13①0.51±0.09①miR-22抑制物組1.02±0.072.36±0.19①2.30±0.08①1.31±0.03①

3討 論

OA是最常見的關節退行性疾病，病變主要累及膝關節、踝關節、髖關節等負重關節，亦常見于指間關節、腕關節等活動關節[13]。OA臨床主要表現為受累關節進行性疼痛、腫脹，關節間隙變窄，骨贅生物形成，活動受限等[14]。目前認為，關節軟骨退變、分解是骨關節主要的病理改變之一[15]。軟骨細胞是軟骨組織中唯一存在的細胞類型，對于維持生理條件下軟骨組織合成與分解代謝的穩態具有重要意義[16]。在OA發病過程中，各種致病因素共同作用下，軟骨細胞合成的Ⅱ型膠原等功能蛋白減少并且結構異常，功能受損，正常細胞表型逐漸丟失，無法維持軟骨基質穩態，促進了OA的發生與發展[17]。因此，本研究聚焦關節軟骨細胞，通過胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶序貫消化軟骨基質，獲得健康、OA原代軟骨細胞，應用于后續研究可最大限度模擬人體內環境。

microRNA是一類非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動植物體內，在進化中高度保守。近年來研究表明，microRNA廣泛參與了骨關節發病與進展，受到廣泛關注。在大鼠膝關節OA模型中，上調miR-29a可通過TLR4/Myd88/NF-κB信號通路失活化抑制大鼠滑膜細胞炎癥反應，保護滑膜損傷，延緩OA進展[18]。Yan等[10]報道，microRNA-34a通過抑制SIRT1/P53通路，促進軟骨細胞凋亡，參與了OA發病。文獻[11, 12]報道，microRNA-22在OA軟骨組織、關節液中異常高表達，提示microRNA-22可能參與了OA發生與發展。同時，研究表明microRNA-22在多種疾病中可調控細胞自噬[19, 20]，由此我們設計了本研究方案，探索microRNA-22對軟骨細胞自噬的影響，進而初步闡釋microRNA-22在OA發病機制中的重要作用。

通過檢測microRNA-22在健康、軟骨細胞中的表達水平，發現microRNA-22在OA軟骨細胞中異常高表達，同時檢測健康、OA軟骨細胞中自噬水平，發現OA軟骨細胞中自噬水平受到抑制。因此我們認為，microRNA-22可能通過調控軟骨細胞自噬，促進OA的發生與發展。

細胞自噬是一種自我降解的過程，真核細胞通過降解異常狀態的細胞器、大分子，以維持細胞正常的新陳代謝[21]。研究表明，生理水平的細胞自噬對于軟骨細胞維持軟骨組織正常生理功能具有十分重要的意義，同時在體內軟骨細胞自噬水平隨著年齡增加而衰減[22]。本實驗中通過轉染microRNA-22模擬物、抑制物，上調、下調軟骨細胞中microRNA-22的表達水平，發現轉染microRNA-22模擬物可抑制軟骨細胞自噬，同時抑制軟骨細胞特征性蛋白—Ⅱ型膠原的表達；與之相反，轉染microRNA-22抑制物可促進軟骨細胞自噬，同時促進軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達，提示microRNA-22通過抑制軟骨細胞自噬，參與了OA的發病與進展。

文獻[23]研究表明，軟骨組織損傷時，軟骨細胞會進入增殖狀態，以應對外界環境的不利因素，維持軟骨組織代謝平衡，從而發揮軟骨的生理功能。平板克隆形成實驗中，我們發現轉染microRNA-22模擬物可抑制軟骨細胞克隆形成能力，轉染microRNA-22抑制物可促進軟骨細胞克隆形成，提示microRNA-22可抑制軟骨細胞增殖能力，在OA發病中起到重要作用。

綜上所述，本研究發現microRNA-22在OA軟骨中異常高表達，OA軟骨細胞中自噬水平受到抑制，與此同時，上調軟骨細胞中microRNA-22水平可抑制軟骨細胞自噬，抑制軟骨細胞增殖能力，抑制軟骨細胞Ⅱ型膠原合成，促進OA發病。由此可見，microRNA-22可作為OA潛在的臨床診斷的特征性分子和治療靶點，受到進一步關注。本實驗僅在體外細胞學水平進行了探索，仍需進一步在動物實驗中進行驗證。