獼猴桃潰瘍病檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展概述

王燕平，易春燕，張翠翠，陳慶東，涂美艷

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066； 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

獼猴桃是一種雌雄異株的多年生大型落葉藤本漿果，具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，富含豐富的VC，被稱為“果中之王”。近年來，各地區(qū)獼猴桃患病的報(bào)道越來越多，尤其是獼猴桃潰瘍病。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是世界范圍內(nèi)的重大植物病害之一，主要是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(PSA)引起[1]，該病菌是中國、美國、新西蘭和歐洲植物保護(hù)組織(EPPO)的植物檢疫對(duì)象，具有傳播速度快、致病性強(qiáng)、發(fā)病部位多、防治困難等特點(diǎn)。

獼猴桃潰瘍病是目前無法根治的一種病害，以預(yù)防為主，一旦整株患病至末期只能進(jìn)行銷毀。近年獼猴桃苗木頻繁引種，檢疫把關(guān)不嚴(yán)，導(dǎo)致獼猴桃潰瘍病在各地陸續(xù)發(fā)生[2]，該病在全國范圍內(nèi)已報(bào)道的獼猴桃主產(chǎn)區(qū)都造成了嚴(yán)重的危害，感染Psa日趨嚴(yán)重，影響果實(shí)品質(zhì)和商品性，因此Psa的早期診斷、早期預(yù)防是預(yù)防大面積爆發(fā)獼猴桃潰瘍病的前提。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，獼猴桃潰瘍病的檢測(cè)主要是基于PCR原理，而常規(guī)的PCR技術(shù)并不能準(zhǔn)確區(qū)分檢測(cè)樣中病原菌的生存狀態(tài)，導(dǎo)致檢測(cè)出假陽性的結(jié)果，因而急需建立有效的檢測(cè)手段來鑒別Psa。本文闡述近年所采取的獼猴桃潰瘍病檢測(cè)技術(shù)，以期為獼猴桃潰瘍病的快速檢測(cè)和防控研究提供參考。

1 獼猴桃潰瘍病概況

1.1 病原菌的生物學(xué)特性

Psa為好氧菌，短桿狀或稍有彎曲的兩端鈍圓的革蘭氏陰性細(xì)菌，多數(shù)具有1根鞭毛，少數(shù)有2～3根鞭毛，不產(chǎn)芽孢，無莢膜。在牛肉膏培養(yǎng)基上菌落為乳白色、圓形、邊緣光滑，生長緩慢；該菌喜好低溫、高濕及強(qiáng)光照；能在含有蔗糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)生果聚糖，菌落呈現(xiàn)粘液狀。病菌對(duì)高溫適應(yīng)性差，15～25℃是最適宜生長溫度。

1.2 分布與危害

獼猴潰瘍病是一種嚴(yán)重為害獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的毀滅性病害，該病于1980年在日本和美國首次發(fā)現(xiàn)，此后相繼在中國、意大利、新西蘭等國發(fā)生。近年來，在我國的陜西、四川、貴州、湖南、江蘇和浙江等16個(gè)省份發(fā)生流行、危害，獼猴桃主產(chǎn)區(qū)頻繁流行，發(fā)病普遍嚴(yán)重，嚴(yán)重地阻礙了我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1.3 危害癥狀

病菌主要危害獼猴桃的主干、枝蔓、嫩梢、葉片及花蕾等部位，造成枝條枯死、整株死亡。近年來發(fā)現(xiàn)國際間Psa的傳播可能是通過花粉、幼苗等進(jìn)出口方式進(jìn)行傳播。樹干或枝條在感病后凸起開裂，染病部位的皮層初期溢出乳白色菌膿，后期形成黃褐色或銹紅色粘液。感病葉片呈現(xiàn)褐色不規(guī)則或多角形病斑，周圍常伴有黃色暈圈。花蕾感病后，部分不能開花，花蕾變褐枯死。即使開花結(jié)果，果小易造成落果、畸形果。

1.4 發(fā)生流行規(guī)律

病菌多從枝蔓及枝條等部位侵入，主要借助風(fēng)雨、昆蟲、苗木攜帶或農(nóng)事操作進(jìn)行傳播。該病菌主要在病株組織中越冬，也可隨病殘?bào)w在土壤中越冬。獼猴桃潰瘍病屬于低溫、高濕病害，冬季及初春溫度的急劇變化，是導(dǎo)致潰瘍病發(fā)生流行的關(guān)鍵因子，低溫有利于該病發(fā)生，高溫阻礙其流行。

1.5 綜合治理

目前對(duì)獼猴桃潰瘍病的防控主要采用綜合治理措施，提前預(yù)防是防治其病害的關(guān)鍵。綜合治理包括：①加強(qiáng)植物檢疫工作。獼猴桃潰瘍病作為一種全國檢疫性森林病害，新建果園在栽培引種的過程中要確保外來苗木不攜帶潰瘍病菌。②加強(qiáng)栽培管理。加強(qiáng)冬季的清園防治工作，進(jìn)行農(nóng)事操作時(shí)避免造成大量傷口。③選育和利用抗病品種。目前，利用優(yōu)良的抗獼猴桃潰瘍病品種是控制該病害最為有效和經(jīng)濟(jì)的措施。④化學(xué)藥劑防治。使用化學(xué)藥劑是目前防治潰瘍病最主要、最直接的防治措施。國內(nèi)眾多研究者對(duì)潰瘍病的室內(nèi)及田間化學(xué)藥劑的篩選做了大量工作，對(duì)有效試劑的使用等有諸多研究成果。

2 獼猴桃潰瘍病檢測(cè)技術(shù)研究概述

2.1 直接PCR檢測(cè)技術(shù)

李智念等[3]優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，無需病原物培養(yǎng)和DNA提取過程，直接以獼猴桃枝條為樣本進(jìn)行PCR，使用紫外手電筒代替凝膠成像系統(tǒng)來判斷。付博等[4]對(duì)獼猴桃潰瘍病快速檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化，樣品病健交界處用金氏B培養(yǎng)液浸泡以及PCR體系中加入10%甘油，提升擴(kuò)增效率。建立田間無癥狀樣本快速檢測(cè)，無癥狀帶菌樣品浸提液中加入Na2SO3，為獼猴桃潰瘍病早期診斷提供技術(shù)支撐。

2.2 RT-PCR

劉蕓宏[5]應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Psa-V活菌，對(duì)于染菌花粉樣品，增菌12h，靈敏度可達(dá)1.39×101CFU/g，該方法對(duì)陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)Psa-V活菌定量檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

2.3 熒光定量PCR技術(shù)

周大祥[6]研究疊氮溴乙錠EMA-qPCR是一種有效檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法，能有效避免PCR檢測(cè)實(shí)際樣品可能造成的假陽性結(jié)果。劉蕓宏[5]采用疊氮溴化丙啶PMA-qPCR結(jié)合，優(yōu)化PMA最佳濃度為105μg/mL、培育時(shí)間為8min、曝光時(shí)間為20min，結(jié)果表明應(yīng)用人工染菌后的枝條樣品，最低檢出限為6.30×104CFU/mL。謝錦添[7]等根據(jù)hrpW基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，擴(kuò)增片段247bp，該方法可檢測(cè)無病癥枝條中最低濃度8.45×10-5ng/μL的PSA病原菌，對(duì)獼猴桃潰瘍病感病樣品的早期診斷提供幫助。

2.4 巢式PCR

曹凡[8]以Gallelli檢測(cè)法為基礎(chǔ)改進(jìn)巢式PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)獼猴桃枝條、葉片、雄花Psa進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明有Psa典型癥狀的樣品陽性率為76.67%，雄花Psa的陽性率為55%。無Psa典型癥狀的樣品陽性率為41.67%，雄花Psa的陽性率為50%，該方法可以對(duì)早期Psa進(jìn)行鑒定。

2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)LAMP

王一波等[9]設(shè)計(jì)優(yōu)化LAMP反應(yīng)的檢測(cè)體系，優(yōu)勢(shì)為特異性強(qiáng)、靈敏度高、設(shè)備簡單、反應(yīng)時(shí)間短以及結(jié)果可視化；能夠特異性檢測(cè)出Psa病原菌的靈敏度為100CFU/mL，LAMP能夠檢測(cè)獼猴桃潰瘍病不同的發(fā)病部位，該方法能夠廣泛應(yīng)用于田間的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病快速檢測(cè)。

2.6 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

郭麗倩[10]以獼猴桃潰瘍病菌為免疫原，通過雜交瘤技術(shù)制備抗獼猴桃潰瘍病菌的單克隆抗體，以單抗為核心建立可特異、靈敏檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的ACP-ELISA、dot-ELISA血清學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)，該方法檢測(cè)病菌的極限分別為0.9×102和3.6×103CFU/mL，為我國獼猴桃潰瘍病的檢測(cè)診斷和科學(xué)防治提供技術(shù)支撐。

3 討論

雖然目前建立的Psa檢測(cè)的方法有很多，但也存在一些應(yīng)用推廣的缺點(diǎn)，專業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)具備專業(yè)人員和設(shè)備，而田間果農(nóng)不具備專業(yè)的設(shè)備和檢測(cè)技術(shù)，而且PCR技術(shù)存在檢測(cè)結(jié)果假陽性，為了檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠，應(yīng)多種檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合。應(yīng)重視關(guān)于獼猴桃潰瘍病的早期檢測(cè)，為獼猴桃潰瘍病菌的潛伏期診斷、種群動(dòng)態(tài)檢測(cè)以及植物檢疫工作提供技術(shù)參考。