加壓毛細(xì)管電色譜法在中藥分析中的研究進(jìn)展*

張瀟晗，牛麗穎,2,3，畢曉東,2,3

(1 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2 河北省中藥配方顆粒創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091；3 河北省中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，河北 石家莊 050091)

加壓毛細(xì)管電色譜(Pressurized capillary electrochromatography, pCEC)是結(jié)合了毛細(xì)管電色譜和高效液相色譜法的一種新發(fā)展起來(lái)的分離分析技術(shù)，其主要特點(diǎn)如下：(1)雙重流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力：在傳統(tǒng)壓力泵驅(qū)動(dòng)管路流體的基礎(chǔ)上，在分離管理段前后增加電極結(jié)構(gòu)，提供了電滲流的驅(qū)動(dòng)力，在電滲流和壓力流的雙重驅(qū)動(dòng)條件下，提供納升到微升范圍內(nèi)的流速[1]；(2)雙重分離機(jī)制：毛細(xì)管內(nèi)填料可以提供色譜固定相的分配、吸附、親和等分離機(jī)制，而且由于毛細(xì)管內(nèi)徑小，方便操作，制備固定相填料所需試劑用量少，適合研究級(jí)新型毛細(xì)管固定相的開發(fā)，同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH調(diào)控分析物的不同帶電情況，在電場(chǎng)作用下產(chǎn)生差速效應(yīng)，使pCEC在分離機(jī)制上兼具毛細(xì)管微柱色譜和毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢(shì)；(3)儀器結(jié)構(gòu)靈活：由于采用毛細(xì)管作為分離管路[2]，可以通過(guò)多通閥切換等技術(shù)增加管路的復(fù)雜度，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定進(jìn)樣、多維分離等功能，管路的維度也方便將pCEC整合到微流控芯片中實(shí)現(xiàn)儀器的微型化，檢測(cè)器方面[3]，pCEC由于分離段末端有電極，可以方便與質(zhì)譜的ESI結(jié)構(gòu)對(duì)接，或者采用電化學(xué)檢測(cè)方法，使其檢測(cè)手段更為豐富。近些年對(duì)于pCEC的關(guān)注度越來(lái)越高，相關(guān)綜述性文章也十分豐富，主要分為三大類：第一類是側(cè)重pCEC原理和技術(shù)的總結(jié)[2]；第二類是對(duì)于毛細(xì)管色譜柱制備以及應(yīng)用的總結(jié)[4]；第三類是關(guān)于pCEC在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品、蛋白質(zhì)組學(xué)等新興科技的應(yīng)用[5]。本文聚焦加壓毛細(xì)管電色譜在中藥分析中的應(yīng)用，從pCEC固定相、分析方法、應(yīng)用研究等幾個(gè)方面對(duì)近幾年的文獻(xiàn)進(jìn)行歸納整理，并根據(jù)現(xiàn)有研究情況對(duì)pCEC技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望，為pCEC在中藥分析中開展深入研究提供了一定的參考(文章概況參考圖1)。

圖1 文章思維導(dǎo)圖

1 pCEC固定相

分離常用的毛細(xì)管內(nèi)徑在50～250 μm范圍，對(duì)其進(jìn)行液體充填和控制需要的流速在微升/分鐘的數(shù)量級(jí)，采用微量流速泵或者注射器即可方便實(shí)現(xiàn)物理填充，此外，由于毛細(xì)管內(nèi)壁富含硅羥基，可以通過(guò)硅烷化試劑等方法進(jìn)行化學(xué)修飾或者鍵合其他材料，相比采用鋼柱的常規(guī)液相色譜，pCEC的固定相形式更為豐富，主要有填充柱、整體柱和開管柱三大類。

1.1 填充柱

毛細(xì)管填充柱指將粒度在1～5 μm的固體色譜填料填充至石英毛細(xì)管中，得到的色譜柱[4]。其中常用的反向填料是二氧化硅，常用的手性填充固定相有多糖和分子印跡聚合物等。作勻漿法是最為常用的填充方法，該方法的操作簡(jiǎn)單，對(duì)于設(shè)備的要求低。但是由于毛細(xì)管色譜柱不適用常規(guī)離柱的不銹鋼塞子，柱塞過(guò)大可能會(huì)引起死體積過(guò)大。在實(shí)際制備柱塞的操作中容易出現(xiàn)氣泡、重現(xiàn)性差、分離速度慢等問(wèn)題，因此對(duì)于柱塞的制備較為困難。目前柱塞的制備方式主要有四種；燒結(jié)填充固定相法、硅酸鉀-甲酰胺聚合法、溶膠-凝膠固結(jié)固定相法以及多孔有機(jī)聚合物[6]。 李英杰等[7]以羧基丁二酰β-環(huán)糊精微球?yàn)槭中怨潭ㄏ嘀苽?～10 μm填料內(nèi)徑的毛細(xì)管電色譜填充柱，拆分兩種手性藥物對(duì)映體和氨基酸，試驗(yàn)結(jié)果表明所制備的手性填充柱拆分能力好，四種對(duì)映體均得到基線分離。Yonglei Wu等[8]將L-半胱氨酸修飾在二氧化硅微球上制備出了一種新型高分子材料下的二氧化硅毛細(xì)管填充柱，用于糖肽類化合物的富集與分析，具有良好的靈敏度和選擇性。

1.2 整體柱

毛細(xì)管整體柱是在毛細(xì)管內(nèi)原位反應(yīng)制得，分為有機(jī)聚合物整體柱①聚丙烯酰胺類整體柱；②聚苯乙烯類整體柱；③聚甲基丙烯酸酯類整體柱；④分子印跡整體柱、無(wú)機(jī)硅膠整體柱和有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱[6]。有機(jī)聚合物整體柱的制備先對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)處理，再將單體、交聯(lián)劑、制孔劑、引發(fā)劑混合液引入毛細(xì)管，發(fā)生原位聚合反應(yīng)，最后沖洗制得[9]。硅膠整體柱的制備主要是溶膠-凝膠法。有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱的制備主要是通過(guò)縮合聚合法和縮合聚合協(xié)同自由基引發(fā)聚合法。實(shí)驗(yàn)研究表明整體柱的內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻、重現(xiàn)性好、具有良好的多孔性、柱效高可實(shí)現(xiàn)快速分離，具有深入的研究?jī)r(jià)值。李英杰等[9]以烯丙基咪唑鎓β-環(huán)糊精為功能單體，EDMA為交聯(lián)劑制備了一種毛細(xì)管電色譜整體柱，實(shí)驗(yàn)表明該毛細(xì)管整體柱對(duì)對(duì)映體的分離能力較強(qiáng)。李英杰等[10]以N-烯丙基咪唑β-環(huán)糊精和功能化Uio-66為單體制備了一種新型的雜化整體柱，該整體柱成功分離了喹禾靈和禾草靈兩種手性農(nóng)藥對(duì)映體，實(shí)驗(yàn)表明該整體柱在拆分手性化合物方面具有很高的研究?jī)r(jià)值。

1.3 開管柱

毛細(xì)管開管柱是通過(guò)在柱內(nèi)壁制備一種薄層固定相得到的，主要方式分別有鍵合法、涂布法以及溶膠-凝膠法。趙凌藝等[11]通過(guò)共價(jià)鍵合法制備了二維吖嗪COF涂層毛細(xì)管，用于分離硝基苯酚類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。劉元元等[12]合成了一種基于纖維狀二氧化硅納米和聚合物的新型二氧化硅納米毛細(xì)管開管柱，成功的用于磺胺類物質(zhì)的分離與分析中，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，為磺胺類等堿性物質(zhì)的分析與分離提供了技術(shù)支持。Genlin Sun等[13]以乙烯二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑制備了一種毛細(xì)管開管柱，并完成對(duì)5種合成肽的分離。該實(shí)驗(yàn)為一些復(fù)雜的生物樣品的分離提供了新思路。

表1 三類柱子的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比以及應(yīng)用

2 pCEC在中藥分析中的應(yīng)用

目前藥品市場(chǎng)上種類較多成分復(fù)雜，尤其對(duì)于一些中藥制劑來(lái)說(shuō)，分離分析難度更大。目前對(duì)于中藥的分析分離方法主要有高效液相色譜法(HPLC)以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)，而HPLC法需要消耗較多的有機(jī)試劑，HPLC-MS法的儀器昂貴。加壓毛細(xì)管電色譜所需有機(jī)試劑少，柱效高，分析速度快，因此近些年來(lái)加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)在中藥分析領(lǐng)域取得了良好的效果。pCEC在中藥分析中的應(yīng)用發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)年份分布參考見圖2(知網(wǎng)檢索)。

圖2 相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表年份分布

2.1 生物堿

吳漪等[14]以加壓毛細(xì)管電色譜為技術(shù)平臺(tái),對(duì)中藥黃柏指紋圖譜中的方法學(xué)進(jìn)行了研究。通過(guò)在色譜柱上施加不同的電壓，發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)黃柏中的主要成分藥根堿、巴馬汀和小檗堿隨電壓的不同出峰順序不同，說(shuō)明了pCEC對(duì)于一些復(fù)雜樣品的分離是一種更有效的途徑。吳孔弦等[15]采用pCEC, 建立了銀杏葉的 pCEC指紋圖譜。該方式所需試劑用量少，對(duì)于復(fù)雜樣品的分析能力強(qiáng)，作者利用pCEC對(duì)10批不同產(chǎn)地的銀杏葉藥材進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果理想，對(duì)于銀杏葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了一種新的評(píng)價(jià)方法。分離生物堿時(shí)常采用C18柱子，常以甲醇-水，或乙腈-水為流動(dòng)相，氨水或三乙胺為添加劑，可得到良好的分離效果。

2.2 黃酮類化合物

趙彥勇等[16]采用pCEC，建立了一種用于分離檢測(cè)芎菊上清片中梔子苷和黃芩苷的高效簡(jiǎn)便的新方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的選擇性好、柱效高、試劑用量少，為中成藥芎菊上清片的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。張平等[17]采用加壓毛細(xì)管電色譜法測(cè)定復(fù)方蘆丁片中蘆丁與維生素 C 的含量，當(dāng)電壓加到-5 kV時(shí)基線分離，最終實(shí)驗(yàn)選定電壓為-8 kV，該電壓下峰型最好。與原國(guó)標(biāo)方法相比，結(jié)果基本一致，并且該方法簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確有效，為復(fù)方蘆丁片質(zhì)量控制提供了新檢測(cè)技術(shù)。

2.3 醌類化合物

肖曉茹等[18]利用加壓毛細(xì)管電色譜法分離檢測(cè)虎杖根中蒽醌類成分，在電滲流和壓力流的雙重驅(qū)動(dòng)下，分離速度與效能均有一定的提高，試劑消耗量少取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顏流水等[19]建立了同時(shí)分離大黃提取液中的五類蒽醌類化合物的梯度加壓毛細(xì)管電色譜新方法，實(shí)驗(yàn)顯示利用pCEC五種醌類化合物可在22分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離，該柱效是梯度微柱液相色譜的4.6倍。對(duì)于醌類化合物的分析分離常用的毛細(xì)管色譜柱是C18熔硅毛細(xì)管柱，建立了一種高效快速分離中藥復(fù)雜體系中多成分組分的新方法，在中藥這一類的復(fù)雜體系的質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要的作用。

2.4 糖苷類化合物

許歆瑤等[20]利用加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)高效分離葛根多糖中的單糖，建立了柱前衍生加壓毛細(xì)管電色譜檢測(cè)糖類的方法。該方法與傳統(tǒng)的液相色譜比較，分離速度和柱效大大提升。該研究為以后對(duì)于單糖類化合物的研究提供了一個(gè)新的高效快速分析分離方法。用pCEC分離單糖所使用的色譜柱為C18核殼型Halo柱，常用的檢測(cè)器為紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器。分離糖苷類化合物常用以硅膠為填料，鍵合了氨基甲?；纳V柱。王玉紅等[21]利用加壓毛細(xì)管電色譜-微流蒸發(fā)光散射檢測(cè)聯(lián)用儀檢測(cè)果糖、葡萄糖和蔗糖。該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了流動(dòng)相、電場(chǎng)強(qiáng)度、溫度等條件，與HPLC對(duì)比該方法快速靈敏并且經(jīng)濟(jì)環(huán)保，為糖類物質(zhì)的檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)手段。

2.5 苯丙素類化合物

陳怡等[22]利用pCEC分離和定量分析白芷根中的香豆素類化合物，該實(shí)驗(yàn)在同等色譜條件下也進(jìn)行了高效液相色譜和毛細(xì)管液相分離。試驗(yàn)結(jié)果表明pCEC的分離時(shí)間更短，柱效更高。胡延等[23]采用反向加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)檢測(cè)中藥厚樸中和厚樸酚與厚樸酚，建立了一種快速簡(jiǎn)便的分離分析方法。該方法與傳統(tǒng)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法相比，靈敏度更高，重現(xiàn)性更好，流動(dòng)相消耗少，綠色環(huán)保。

3 pCEC在其他方面的應(yīng)用

近些年的研究總結(jié)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于新型毛細(xì)管色譜柱的合成和利用仍是研究熱點(diǎn)。加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)更多的應(yīng)用到食品安全研究[24]、藥物質(zhì)量控制[25]、手性拆分[26]、以及分離蛋白質(zhì)和多肽等的方面[27]。山梅等[28]，采用固相萃取-反相加壓毛細(xì)管電色譜-紫外檢測(cè)技術(shù)測(cè)定水體中八種農(nóng)藥殘留，該方法簡(jiǎn)單、可靠、適用于水中多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)分析測(cè)定。柳青等[29]將pCEC與MS相結(jié)合，將電噴霧電離源的噴霧接口重新設(shè)計(jì)經(jīng)行改造和優(yōu)化，因此噴霧效率和檢測(cè)的靈敏度都得以提高。該平臺(tái)搭建的加壓毛細(xì)管電色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)擴(kuò)大了pCEC的應(yīng)用領(lǐng)域，同時(shí)對(duì)于一些復(fù)雜的微量樣品的分析提供了技術(shù)指導(dǎo)。對(duì)于加壓毛細(xì)管電色譜的條件以及應(yīng)用可參考見表2。

表2 加壓毛細(xì)管電色譜的應(yīng)用條件以及文獻(xiàn)來(lái)源

續(xù)表2

4 結(jié) 語(yǔ)

隨著現(xiàn)代醫(yī)藥的不斷發(fā)展，中藥對(duì)于人們來(lái)說(shuō)也展示出越來(lái)越重要的作用。但是由于中藥以及一些中藥復(fù)方制劑的成分復(fù)雜，使得傳統(tǒng)的分析分離技術(shù)受限，加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)顯示出來(lái)了極大的潛力。pCEC充分整合了毛細(xì)管微柱色譜、毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢(shì)，可以針對(duì)生物、環(huán)境等復(fù)雜樣品方便開發(fā)新型固定相，又與質(zhì)譜、多維液相色譜、微流控芯片等技術(shù)具有很好的兼容性，今年來(lái)備受關(guān)注。同時(shí)pCEC在生物樣品分析[40]、環(huán)境分析[41]以及食品分析[42]中也展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價(jià)值。加壓毛細(xì)管電色譜作為一種藥典上沒(méi)有收錄的新方法，pCEC較多的應(yīng)用于各大高校，而對(duì)于各個(gè)企業(yè)應(yīng)用較少。加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)的“心臟”是毛細(xì)管色譜柱，毛細(xì)管色譜柱在一定的程度上影響了物質(zhì)的分離效果，因此毛細(xì)管色譜柱的制備仍是研究的重點(diǎn)[43]。色譜柱由傳統(tǒng)的色譜柱發(fā)展為現(xiàn)在的毛細(xì)管色譜柱，柱子發(fā)展的越來(lái)越細(xì)，符合現(xiàn)在硬件設(shè)備的“微信化”，將來(lái)毛細(xì)管色譜柱的進(jìn)一步發(fā)展成無(wú)線檢測(cè)。加壓毛細(xì)管電色譜與微流控芯片結(jié)合[44]，實(shí)現(xiàn)超快分離，發(fā)展成一臺(tái)便攜機(jī)器，更加方便地應(yīng)用于食品藥物，環(huán)境等方面的檢測(cè)。盡管加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)的開發(fā)研究時(shí)間較短，但是近幾年pCEC作為一項(xiàng)新型的分析分離技術(shù)發(fā)展迅速，逐漸成熟，必將擁有廣闊的應(yīng)用前景。