艾葉揮發油成分分析及其抗氧化活性譜效關系*

李雨銘，李齊激,3，王 麗，楊 艷，葛麗娟，楊小生,3

(1 貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3 貴州省天然產物高效利用工程研究中心，貴州 貴陽 550014)

艾葉為菊科蒿屬多年生草本植物艾ArtemisiaargyiLevl.et Vant的干燥葉，廣布于全國各地[1]。作為我國重要的藥食用植物資源，艾葉在醫藥保健與生活日常中得到廣泛應用，特別是在抗氧化、抗炎、抗菌、抗過敏、驅蟲等方面[2-3]。揮發油作為艾葉功效不可或缺的物質基礎，目標組分的清晰與否對后續精油加工與產品研制至關重要。由于揮發油難分離的特殊性，現有艾葉揮發油主要含有單萜、倍半萜、酮、醛、醚、脂肪酸等多種類型的化合物[4]；針對艾葉揮發油的研究主要集中在成分組成、功效與生物機制方面[5-6]，關于其組成成分與功效的關系構建研究鮮見報道。前述原因的疊加，造成了艾葉揮發油主要功效組分的不明晰，也成為制約后續精油加工與產品研制的重要影響因素。

隨著現代藥學技術的發展，通過把生物活性與光譜、色譜行為相結合的“譜效關系”得到廣泛應用，該方法為闡明傳統藥物功效與物質間的相關性提供新的思路[7-9]。本文以艾葉揮發油在醫藥、日化產品中廣泛應用的抗氧化活性為基礎，通過把揮發油GC-MS成分分析與抗氧化活性相關結合，利用聚類分析法、灰色關聯度法構建艾葉揮發油不同類型組分與抗氧化活性的譜效關系，為艾葉揮發油精制及其產品加工過程提供參考。

1 儀器與試劑

艾葉于2021年6月購于山東棗莊(S1)、廣西南寧(S2)、陜西商洛(S3)、河南南陽(S4)、北京(S5)、福建平和(S6)、湖北襄陽(S7)、安徽淮南(S8)、貴州黔南(S9)、江蘇徐州(S10)等地,經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為菊科蒿屬艾(ArtemisiaargyiLevl.et Vant)。

乙醇(分析純，批號：20210623)；1，1-二苯基-2-三硝基苯阱(DPPH)，上海梯希愛化成工業發展有限公司；2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽(ABTS，批號：20220407)，南京建成生物研究所；總抗氧化能力試劑盒(FRAP，批號：20220406)，南京建成生物研究所；HP6890/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；Vaioskan LUX酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；JA2003電子天平，上海菁海儀器有限公司。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent HP-5MS彈性石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫40 ℃，保持1 min，以3.5 ℃/min升溫至180 ℃，再以10 ℃/min升溫至310 ℃，運行62 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓15.98 psi，載氣流量1.0 mL/min；分流比20:1；溶劑延遲6 min。

離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1824 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist20和Wiley275標準質譜圖，確定艾葉揮發性化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數。

2.2 試驗方法

2.2.1 艾葉揮發油提取

參照《中國藥典》(2020年版)一部中揮發油提取法-水蒸氣蒸餾法進行提取[10]。分別取粉碎后不同產地艾葉各50 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，進行水蒸氣蒸餾6 h，待揮發油含量不再增加時停止加熱，取油相成分密閉保存。

2.2.2 抗氧化活性測定

(1)溶液制備

取適量S1～S10艾葉揮發油，分別制備成質量濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL的樣品溶液。精密稱取Vc適量，依次制備成相同質量濃度對照品溶液，-5 ℃避光保存，現配現用[11]。

(2)DPPH自由基清除能力測定

吸取100 μL，0.1 mmol/L DPPH與等體積不同質量濃度樣品溶液于96孔板內(避光孵育30 min)，以無水乙醇為對照品，517 nm處測定吸光度Ai。無水乙醇與等體積0.1 mmol/L DPPH溶液混合液吸光度Ae，無水乙醇與等體積樣品溶液混合液吸光度Aj，重復三次取平均值[11]。按照如下公式計算樣品溶液自由基清除率:

(3)ABTS陽離子自由基清除能力測定

吸取10 μL系列濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mM的Trolox溶液，與20 μL酶溶液(配置溶液)、170 μL ABTS溶液混合，以蒸餾水為對照品(室溫反應6 min)，405 nm處測定吸光度，以吸光度值為橫坐標，Trolox溶液濃度為縱坐標繪制標準曲線。吸取10 μL待測樣品以Trolox溶液配置方式測定吸光度，重復三次取平均值[11]。根據標準曲線計算待測樣品的當量濃度，計算該濃度下Trolox的摩爾濃度除以待測樣品的質量濃度，最后以mmol/g表示。

(4)總抗氧化能力測定

吸取5 μL系列濃度為0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mM的FeSO4-7H2O溶液，與180 μL的FRAP溶液混合，蒸餾水為對照品，37 ℃下孵育3～5 min，593 nm處測定吸光度，各孔減去空白組OD值后，以FeSO4-7H2O溶液的OD值為橫坐標，FeSO4-7H2O溶液的濃度為縱坐標繪制標準曲線。吸取5 μL待測樣品以FeSO4-7H2O溶液配置方式測定吸光度值，重復三次取平均值[11]。根據標準曲線，將樣品測定的吸光度值(減去空白組吸光度值后)獲得相應的FeSO4-7H2O濃度，表示為當量濃度(FRAP值)。結果以每mg樣品中FeSO4-7H2O的量(mmol/L)表示。

2.2.3 統計學方法

采用SPSS 26.0進行數據處理；Origin、Tbtools進行圖表繪制。

2.3 艾葉揮發油中成分GC-MS分析

經GC-MS分析，峰面積歸一化法確定了10產地艾葉揮發油的相對含量，采用Nist20和Wiley275標準質譜圖比對，按80以上匹配度進行歸屬，從揮發油中共計鑒定化學成分428種，10產地艾葉揮發油總離子流圖見圖1。

圖1 不同產地艾葉揮發油GC-MS總離子流圖

從S1～S10的艾葉揮發油分別鑒定出78、104、118、79、95、136、109、123、110和118種成分，相對含量依次為85.729%、84.155%、79.632%、76.783%、92.234%、73.906%、88.861%、88.937%、78.938%和87.827%。根據這些化學成分的特點，10產地艾葉揮發油成分類型有倍半萜類(110種)、單萜類(111種)、長鏈不飽和烴類(85種)、長鏈烷烴類化合物(9種)、酚類化合物(18種)和其他類化合物(95種)，其中倍半萜類和單萜類成分占51.63%。

從單一產地揮發油成分占比來看，各產地仍以倍半萜類和單萜類成分為主，如山東棗莊(S1)產樣品中含大量蘭香油奧(31.257%)、石竹烯(3.509%)等，廣西南寧(S2)產樣品中崖柏酮(22.179%)、石竹烯(10.068%)、桉油精(7.705%)等接近40%，北京(S5)產樣品中含豐富的[1S-(1α,4α,5α)]-4-甲基-1-(1-甲基乙基)二環[3.1.0]己烷-3-酮(17.403%)、桉油精(14.341%)，貴州黔南(S9)產樣品中含有大量的長馬鞭草酮(35.32%)、氧化石竹烯(9.366%)等。與之前報道相比，倍半萜類和單萜類主成分基本趨于一致，其它成分變化復雜，主要影響因素或與生長環境、采收期、處理方式等因素有關[12-13]。

2.4 抗氧化活性評價

2.4.1 DPPH自由基清除作用

10個產地艾葉揮發油都具有抑制DPPH自由基產生的作用，并隨著揮發油濃度的增加，自由基清除率呈上升趨勢(圖2)。運用SPSS 26.0計算不同產地的艾葉揮發油清除DPPH自由基的IC50值。S1～S10的艾葉揮發油對DPPH自由基的IC50分別為0.762、0.951、1.600、3.080、1.041、2.045、2.129、1.122、2.937、1.514 mg/mL，陽性對照Vc的IC50為7.08×10-8mg/mL。表明：10個產地艾葉揮發油均具有抑制DPPH自由基產生的作用。DPPH自由基清除能力山東棗莊(S1)最好，其余依次為S2>S5>S8>S10>S3>S6>S7>S9>S4。

圖2 十個產地艾葉揮發油對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 ABTS陽離子自由基清除作用

10個產地艾葉揮發油均可抑制ABTS陽離子自由基的產生，以Trolox吸光度值為橫坐標(X)，Trolox溶液濃度為縱坐標(A)進行回歸，得到回歸方程為A=-0.9867X+1.1394(r=0.9957)。經測定，S1～S10的艾葉揮發油清除ABTS陽離子自由基的能力分別是0.9688、0.8766、0.6145、0.3972、0.8106、0.5957、0.5887、0.7049、0.4770、0.6801 mmol/g。清除ABTS陽離子自由基的能力山東棗莊(S1)最好，其余依次為S2>S5>S8>S10>S3>S6>S7>S9>S4。結果與清除DPPH自由基的能力一致。

2.4.3 總抗氧化能力測定

10個產地艾葉揮發油的總抗氧化能力具有差異，以FeSO4-7H2O溶液的OD值為橫坐標(X)，各OD值對應的FeSO4-7H2O溶液的濃度為縱坐標(A)進行回歸，得到回歸方程為A=0.116X+0.1157(r=0.9984)。經測定，S1～S10的艾葉揮發油的總抗氧化能力(FRAP)均值分別為0.2597、0.1783、0.1573、0.1308、0.1752、0.1429、0.1527、0.1694、0.1340、0.1663 mmol/L。對照品Vc的FRAP均值為8.004 mmol/L。S1～S10總抗氧化能力均小于對照品，總抗氧化能力山東棗莊(S1)最好，其余依次為S2>S5>S8>S10>S3>S7>S6>S9>S4，該結果與DPPH、ABTS法一致。總體來說，山東棗莊(S1)、廣西南寧(S2)、北京(S5)的抗氧化能力最好。

2.5 譜效關系的構建

聚類分析是通過成分差異分析物種相似性與差異性一種方法，而灰色關聯度可把化學組分與藥效指標進行有效聯系，二者結合在譜效關系構建中也有廣泛的應用基礎[7-8]。

2.5.1 聚類分析

采用SPSS 26.0軟件對十個產地的艾葉揮發油成分的相對含量進行聚類分析(圖3)。取閾值為10時，樣品閾值分割后可分為4類，S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10聚為第1類，S2單獨聚為第2類，S1單獨聚為第3類，S9單獨聚為第4類。

圖3 十個產地艾葉揮發油化學成分聚類分析結果

對比各聚類從成分相對含量可知，第1類(S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10)共有成分相對含量在56.61%～73.04%間，如順式對薄荷-2-烯-1-醇、乙酸香芹酯、4(14),11-桉葉二烯、桉油精、馬鞭草烯醇、順式香芹醇、1-石竹烯、Α-葎草萜、氧化石竹烯等。第2～4類除與第1類有相似的共有成分外，多種豐量物質的出現是其單獨聚類的關鍵因素，如第2類(S1)中含有蘭香油奧(31.257%)、右旋大根香葉烯(4.178%)、棕櫚酸(4.847%)、桉油烯醇(4.336%)，第3類(S2)含有大量的崖柏酮(22.179%)、側柏酮(7.318%)、4-萜品醇(6.064%)、二氫香芹醇(3.377%)、甲基環戊烷(2.279%)、4-異丙基甲苯(2.448%)，第4類(S9)含有大量的長馬鞭草酮(35.32%)以及樟腦(2.078%)等。

2.5.2 灰色關聯度分析

結合揮發油組分與功效相關性、日常使用往往以成分類群為主的應用特點等因素[14]，本文將S1～S10中艾葉揮發油化學成分分為長鏈烷烴類(A)、長鏈不飽和烴類(B)、酚類(C)、單萜類(D)、倍半萜類(E)、其他類化合物。進而與抗氧化活性進行灰色關聯度分析，通過關聯度(表1)明確藥效指標和化學成分之間的相關性[15]。

表1 特征成分與IC50的關聯度

由表1可知，S1～S10中單萜(D)和倍半萜類(E)化合物與抗氧化活性的關聯度均大于0.6，說明其與抗氧化活性緊密相關。如S1中，倍半萜類對DPPH自由基的清除貢獻最大(0.934)，其中主成分蘭香油奧(含量為31.257%)也是得到廣泛關注具有顯著抗氧化活性的物質[16]。這與單萜、倍半萜類化合物作為重要抗氧化劑被廣泛應用的事實基本一致[17-18]。

3 結 論

本研究共分析了10個產地的艾葉揮發油的化學成分，共鑒定出428種化學成分，相對含量在73.906%～92.234%之間。抗氧化活性檢測發現山東棗莊(S1)、廣西南寧(S2)、北京(S5)產艾葉揮發油抗氧化能力明顯高于其他產地。進一步的譜效關系分析揭示了單萜、倍半萜為其抗氧化活性的主要成分類群。

總體來說，10個產地的艾葉揮發油化學成分存在一定差異，也表現出一定的抗氧化活性，其活性均與其含有豐富的單萜、倍半萜有著直接的關系。該譜效關系的構建為艾葉揮發油后續產品精制和相關產品研發提供重要依據。