布魯氏菌生物恐怖戰(zhàn)劑RTqPCR現(xiàn)場檢測方法研究

張立安,宗 鵬，任小俠，侯亞欣，王 楠，王慧飛

1.煙臺市消防救援支隊，山東 煙臺 264000； 2.撫州市消防救援支隊，江西 撫州 344000； 3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081； 4.中國人民警察大學 a.研究生院； b.偵查學院，河北 廊坊 065000

0 引言

生物恐怖襲擊是指利用細菌、病毒和毒素等生物制劑作為武器針對人類、動物和農(nóng)作物實施攻擊，造成傷亡、制造恐慌的一種恐怖主義形式。布魯氏菌作為失能型生物恐怖戰(zhàn)劑，可以感染人和牲畜導致布魯氏菌病[1-3]。根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》，布魯氏菌病為乙類傳染病[4]，世界衛(wèi)生組織將其列為B類法定傳染病[5]。根據(jù)疾病預防控制局的資料顯示，2018年我國布魯氏菌發(fā)病人數(shù)為37 947人，截止到2019年11月，2019年發(fā)病人數(shù)達43 635人。2010年東北農(nóng)業(yè)大學27名學生和1名教師感染了布魯氏菌病，2019年12月蘭州獸醫(yī)研究所發(fā)現(xiàn)96人感染布魯氏菌病。布魯氏菌病原體可通過體表皮膚黏膜、消化道、呼吸道侵入機體，人類患病的途徑多樣，包括食用未經(jīng)高溫消毒的牛奶和奶制品，直接接觸受感染的動物組織，誤食、吸入或注射培養(yǎng)的布魯氏菌等[6]。布魯氏菌病會造成嚴重的并發(fā)癥甚至有死亡危險，因此快速精準檢測布魯氏菌、及時進行應急處置顯得尤為重要。

自2000年以來，人類布魯氏菌病是發(fā)病數(shù)上升速度最快的傳染病之一[7-8]，而且布魯氏菌病具有潛伏期，臨床分為急性、亞急性、慢性三類，急性潛伏期在3個月以內(nèi)，慢性潛伏期可達6個月[9]。因此，及時準確偵檢是應對布魯氏菌生物恐怖襲擊的有效措施。目前血培養(yǎng)檢測布魯氏菌病是金標準[10-11]，我國現(xiàn)行《布魯氏菌病診斷標準》(WS 269—2019)規(guī)定SAT和分離布魯氏菌均為檢測方法。布魯氏菌傳統(tǒng)血清學方法檢測的特異性不強，且檢測結(jié)果受檢測人員主觀意識影響較大。細菌分離培養(yǎng)技術(shù)檢測時間較長，檢測對試驗環(huán)境、設備及操作人員要求較高，不適合現(xiàn)場檢測。現(xiàn)場試紙檢測受檢測時機限制及環(huán)境溫度等影響，其靈敏度檢出限還有待技術(shù)完善和提高。分子生物學鑒定是近幾年逐步發(fā)展的技術(shù)，具有特異高效的優(yōu)點，在布魯氏菌基因檢測方面利用核糖體RNA、Omp25、IS711、BCSP31等保守序列做了大量研究和方法構(gòu)建。實時熒光定量PCR(RTqPCR)方法具有靈敏性高、特異性好等特點，在實驗室研究中應用廣泛，反恐應急等部門也做了大量嘗試和探索[12-14]。1990年，F(xiàn)ekete等開創(chuàng)了布魯氏菌PCR檢測先河，并利用多重PCR進行基因分型[15-17]。本文探討適合現(xiàn)場快速檢測布魯氏菌的PCR方法，以期提高應急處突檢測能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

試驗材料：布魯氏菌滅活疫苗株(S2)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈；Sybr Green qPCR mix、Taq PCR MasterMix、細菌基因組DNA快速提取試劑盒均購自北京艾德萊(Aidlab)生物有限公司；D2000 DNA Ladder購自Biosharp公司；Petrifim 6406菌落測試片(3M公司)；布魯氏菌基因的載體構(gòu)建由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑或其配制而成。主要儀器：LightCycler 1.5型實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，MyCycler型PCR儀(美國Bio-rad公司)，JY600C型水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，AlphaDigiDoc實時凝膠處理系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)，MSC12型生物安全柜(美國Thermog公司)。

1.2 檢測方法

1.2.1 生物信息學分析

利用NCBI公布的16S核糖體RNA基因序列，通過BLAST和DNAMAN 6.0對比分析，利用MEGA 6.06軟件的鄰接法進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，分析基因相似性。用Primer Premier 5.0設計上下游引物，如表1所示，引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

表1 引物序列及參數(shù)

1.2.2 質(zhì)粒的提取與鑒定

按照Aidlab高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒的操作步驟提取質(zhì)粒，作為陽性標準品。利用普通PCR進行目的基因鑒定，20 μL反應體系，Taq PCR MasterMix(Aidlab)10 μL，上下游引物B16SF、B16SR各0.5 μL，底物1 μL，雙蒸水8 μL。反應程序為：預變性94 ℃，3 min，1個循環(huán)；變性94 ℃，10 s；退火/延伸60 ℃，30 s，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后成像鑒定。

1.2.3 熒光定量正交試驗

選擇退火時間、退火溫度、引物量設計3水平3因素如表2所示的L9(34)正交試驗。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL：Sybr Green qPCR mix 10 μL，上下游引物qBSF1、qBSR2各nμL，底物1 μL，雙蒸水8 μL。反應程序為：預變性94 ℃，3 min，1個循環(huán)；變性94 ℃，10 s；退火/延伸m℃，ks，40個循環(huán)；溶解曲線40～85 ℃，升溫速率0.2 ℃·s-1。

表2 參數(shù)設置

1.2.4 靈敏度與特異性檢測

以10倍梯度稀釋得到濃度為10-1～10-7的稀釋菌液，取100 μL噴涂在菌落測試片上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌斑，計算菌液濃度。使用稀釋濃度菌液，按照優(yōu)化后的反應體系進行RTqPCR反應，Ct值和溶解曲線分析反應靈敏度和特異性。

1.2.5 環(huán)境樣本測試

采集草坪里的積水和地表土壤樣本，樣本處理方法為：使用移液槍吸取1 mL采集樣本到一個離心管中，3 000 rpm離心5 min，使用移液槍吸取上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，13 000 rpm離心30 s，吸取下層液體作為檢測樣品，進行RTqPCR檢測分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

通過NCBI獲得羊、牛、豬等種類布魯氏菌(Brucella_melitensis_16M、Brucella_abortus、Brucella_ovis、Brucella_suis)的16S rRNA基因序列，通過生物信息學分析，選取高度同源保守序列片段，PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳獲得如圖1所示結(jié)果，與預期相符，且不在其他位置產(chǎn)生擴增條帶。測序?qū)Ρ确治鰹椴剪斒暇?6S rRNA目標基因片段。

圖1 PCR擴增凝膠鑒定結(jié)果

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

PCR反應過程以單鏈DNA為模板，在反應溶液中經(jīng)過變性、退火、延伸、循環(huán)使目的基因得以迅速擴增，PCR反應體系主要有Mix、水、引物和樣品模板。由于Mix為緩沖體系，具有一定緩沖能力，兩步反應中退火過程是引物與模板結(jié)合復制的過程，直接影響PCR的反應效率，引物量是一個重要變量。退火溫度和退火時間是影響RTqPCR反應的兩個條件變量，通過這三個要素的3水平3因素L9(34)正交試驗，結(jié)果如表3所示。在正交試驗中極差R值越大，則表明該因素水平的改變對試驗結(jié)果影響越大，結(jié)果顯示引物量的R值為4.68，遠大于退火時間的1.93和退火溫度的1.62，反應中一般增加反應物濃度有利于反應的正向進行，因此引物量為主要影響因素。k值體現(xiàn)出各單因素對反應的影響。由圖2(a)看出隨著引物量不斷增加，Ct值呈遞減趨勢，0.8 μL時最低，說明隨著引物量的增加，反應進入指數(shù)反應越早，反應越快。但同時也要考慮成本等其他因素，PCR是一個典型的酶促反應，選擇反應體系的最適溫度顯然有利于反應的進行。從圖2(b)看出隨著退火溫度升高，Ct值呈現(xiàn)先增后降趨勢，59 ℃時最低，60 ℃時最高，表明在59 ℃時更有利于反應的進行。圖2(c)則隨著退火時間的增加，Ct值先抑后揚，30 s時Ct值最低，說明退火時間過短和過長都不利反應的進行。因此，通過正交試驗確定三個要素的最優(yōu)反應條件為A3B1C2，最終確定的最優(yōu)反應條件為：總反應體系為20 μL，包括Sybr Green qPCR mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，超純水7.4 μL，引物1 μL；采用兩步法預變性94 ℃持續(xù)5 min，變性94 ℃持續(xù)10 s，退火延伸59 ℃持續(xù)30 s；擴增40個循環(huán)，擴增階段溫度變化速率20 ℃·s-1，每次在退火結(jié)束后收集熒光信號；溶解階段從40 ℃向85 ℃升溫溶解，升溫速率0.2 ℃·s-1，持續(xù)收集熒光信號。

表3 正交反應結(jié)果分析

2.3 實時熒光定量PCR靈敏度與特異性分析

2.3.1 菌落的確定

細菌在Petrifilm測試片上生長時，細胞代謝產(chǎn)物與上層指示劑氯化三苯基四氮唑(TTC)發(fā)生氧化還原反應，將指示劑還原成紅色非溶解性產(chǎn)物三苯甲，從而使細菌著色，故測試片上紅色菌落判斷為菌落總數(shù)，測試片菌落計數(shù)適宜范圍為25～250 CFU。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在區(qū)間，則以最接近區(qū)間的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。將培養(yǎng)的菌液稀釋10-1～10-7倍，噴涂于菌落測試膜片上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，結(jié)果如圖3所示，稀釋10-5倍的菌液在菌落測試片上形成菌斑遠超250個，稀釋10-7倍的菌液在測試片上幾乎看不到菌落，稀釋10-6倍的菌液在測試片上形成菌斑平均為22個，其菌落數(shù)量處理如表4所示，原始菌落濃度為2.2×108CFU·mL-1。

(a)引物量

(b)退火溫度

(c)退火時間

2.3.2 RTqPCR靈敏性分析

RTqPCR是利用熒光信號監(jiān)測PCR過程，只要有熒光信號便可以監(jiān)測出擴增過程。根據(jù)菌落計數(shù)，進行菌液濃度梯度實時熒光定量PCR檢測，圖4中1號樣為陽性對照，2～6號樣分別為菌液稀釋10-3、10-4、10-5、10-6和10-7倍濃度，7號樣為陰性對照。表5列出各組Ct值，隨著稀釋倍數(shù)的增加，Ct值不斷增大，5號樣本菌液稀釋10-6倍時Ct值平均為25.3±0.057，6號樣本菌液稀釋10-7倍時Ct值平均為30.3±0.027。由于采用熒光染料法，實時熒光信號曲線的Ct值在30個循環(huán)后可能出現(xiàn)非特異性擴增，且菌液稀釋10-7倍時菌落無法計數(shù)，因此RTqPCR檢測的菌液濃度至少為220 CFU·mL-1。

圖3 不同稀釋倍數(shù)菌液測試片培養(yǎng)結(jié)果

表4 菌落計數(shù)統(tǒng)計表

表5 不同稀釋濃度布魯氏菌RTqPCR擴增Ct值

圖4 不同稀釋濃度布魯氏菌RTqPCR反應

2.3.3 RTqPCR特異性分析

利用RTqPCR溶解曲線來檢驗擴增產(chǎn)物的單一性，理想的特異性PCR反應一對引物只生成一種產(chǎn)物，且溶解曲線峰值只有一個，圖5(a)陽性樣本和布魯氏菌疫苗株S2反應迅速，很快進入指數(shù)反應階段，呈現(xiàn)S形熒光擴增曲線，其Ct值分別為9.8和13.6；陰性對照和大腸桿菌檢測結(jié)果均為一條平滑直線，均無熒光值增長。圖5(b)顯示在65 ℃附近，出現(xiàn)明顯單一峰，沒有出現(xiàn)雙峰、疊峰、多峰等現(xiàn)象，說明RTqPCR反應沒有出現(xiàn)引物二聚體和非特異性擴增。表明引物設計具有非常強的特異性，擴增產(chǎn)物單一，利用16S rRNA基因片段作為檢測鑒定布魯氏菌具有相當可靠性。

2.4 環(huán)境樣本測試

通過采集室外草坪里的積水和土壤樣本，樣本處理后，進行RTqPCR檢測，結(jié)果如圖6所示，陽性對照產(chǎn)生特異性擴增，土壤樣本和水體樣本Ct值在30以內(nèi)沒有出現(xiàn)擴增信號，表明目標檢測區(qū)域沒有陽性樣本存在。

圖5 RTqPCR特異性檢測圖

3 結(jié)論

根據(jù)NCBI公布的16S核糖體RNA基因保守區(qū)域序列設計合成特異性引物，通過PCR反應進行目的基因的擴增，構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒，優(yōu)化反應條件和擴增體系。用于檢測的特異性目的片段16S rDNA是一種常用的布魯氏菌PCR檢測目標，擴增片段在布魯氏菌屬DNA中高度保守，可以有效將布魯氏菌與其他細菌分離，有利于熒光定量PCR檢測的應用。檢測樣本經(jīng)簡單處理直接作為PCR檢測底物，省去了核酸提取步驟，適用于從各種相態(tài)環(huán)境樣本中快速篩選存在布魯氏菌基因組DNA的樣品。得到本方法用于樣品檢測的檢測限為220 CFU·mL-1菌濃度，并且體系有助于反應快速進入指數(shù)反應，Ct值出現(xiàn)早，且表現(xiàn)出良好特異性。通過采集自然水樣和土壤樣本進行環(huán)境樣本實際檢測，結(jié)果表明該檢測方法對布魯氏菌具有特異性，環(huán)境中其他菌株不會對檢測結(jié)果造成影響。可見，在執(zhí)行生物恐怖襲擊現(xiàn)場偵檢任務時，基于實時熒光定量PCR技術(shù)的基因檢測方法能對布魯氏菌快速、準確識別，滿足檢測需求，為生物恐怖襲擊現(xiàn)場快速檢測布魯氏菌提供一種實用檢測手段。

圖6 模擬檢測熒光信號圖