NFKB1基因多態性與原發性高血壓及血清TNF-α的相關性研究

李超 李俊 盛曉生 余晗俏

原發性高血壓（essential hypertension,EH）是心腦血管疾病的重要危險因素，具有發病率高、致殘率高、致死率高等特點，但其發病機制尚不明確[1]。近年來，越來越多的證據支持遺傳和環境因素相互作用參與EH的發生、發展[2]。此外，單個基因的堿基缺失/插入、置換/易位等不同的遺傳變異也與EH的易感性有關[3-4]。NF-κB是廣泛存在于哺乳動物細胞中的一種重要轉錄因子，調節炎癥基因如TNF-α、IL-6啟動子區表達的調控[5]，參與動脈粥樣硬化、關節炎、高血壓、腫瘤等多種疾病的病理過程。有研究表明，TNF-α通過NF-κB信號傳導發揮作用，促進內皮細胞炎癥反應，引起血管收縮，導致血壓升高[6]。NFKB1基因位于人類染色體 4q24，編碼NF-κB亞單位p105與p50，影響NF-κB表達[7]。NFKB1啟動子單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點由插入/缺失（-94ins/del-ATTG）組成（rs28362491），可以誘導NFKB1基因的調節作用，與各種炎癥性疾病、自身免疫性疾病和癌癥有關[8]，但NFKB1-rs28362491基因多態性與EH的相關性及具體分子機制鮮有報道。本研究探討NFKB1-rs28362491基因多態性與EH及TNF-α水平的相關性，為預測EH發病風險提供一定的科學依據，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2017年6月至2020年6月就診于金華市人民醫院EH患者275例（EH組）和血壓正常的健康體檢者138名（NT組）。EH組男154例，女121例，年齡 55～88（64.37±9.82）歲；NT組男81例，女57例，年齡41～73（62.73±5.83）歲，兩組對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。高血壓診斷標準：在未使用抗高血壓藥物的情況下，非同日3次測量，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg；患者既往有高血壓史，目前正在服用抗高血壓藥物，血壓雖＜140/90 mmHg，也診斷為高血壓[9]。排除標準：患有睡眠呼吸暫停低通氣綜合征、腎實質性高血壓、腎血管性高血壓、原發性醛固酮增多癥、嗜鉻細胞瘤或皮質醇增多癥，長期服用激素類、中樞神經類、非類固醇類抗炎藥物者。本研究經過本院醫學倫理委員會審核通過（批準文號：IBR-2017005-R），受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集所有受試者空腹肘靜脈全血5 ml，置于紫色抗凝管，再按順序編號放入EP管。按照血液基因組DNA提取試劑盒配套說明書（上海生工生物工程有限公司，批號：B518253-0050，規格：50 PREPS）進行DNA提取。使用美國Thermo公司Nano Drop 2000C型紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，DNA濃度50 ng/L，放入-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 NFKB1基因上游啟動子區域-94位點基因型檢測 設計PCR引物，上游引物：5'-TGGGCACAAGTCGTTTATGAT-3'；下 游 引 物 ：5'-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。反應條件：模板 DNA 1.5 μl，PCR mix 12.5 μl，上下游引物 0.4 μl，滅菌超純水10.2 μl，將PCR反應體系的總體積加至25 μl。反應條件：94℃預變性10 min，94℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 45個循環，最后70℃總延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色，凝膠成像系統中進行曝光成像并拍照。

1.2.3 血清指標檢測 抽取受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml，EDTA抗凝管收集，使用ALLEGRAX-15R醫用低速離心機，1 000 r/min，離心15 min，將血清置于-80℃冰箱保存。采用全自動生化分析儀（日本日立，型號：7180）檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,試劑盒購自美康生物科技股份有限公司，批號分別為180409101、180319201、180601114、180613115。采用全自動酶免分析儀（山東博科生物產業有限公司，型號：BIOBASE2000）、ELISA法檢測血清TNF-α水平，試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，批號：ZN2460。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用二元logistic回歸分析EH的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象一般資料比較 兩組對象BMI、吸煙史、飲酒史、LDL-C、TC比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），余指標比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

2.2 NFKB1基因rs28362491位點電泳及測序結果NFKB1基因rs28362491位點其PCR產物長度為326 bp，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型：野生純合（ins/ins,Ⅱ）基因型者，只含240 bp 1個條帶；雜合突變（ind/del,ID）基因型者，含有281 bp及240 bp 2個條帶；純合突變（del/del,DD）基因型者，只含281 bp 1個條帶。見圖1。

圖1 NFKB1基因rs28362491位點酶切產物電泳圖

2.3 兩組對象基因多態性分布比較 NFKB1基因rs2836249位點的基因型及等位基因頻率在EH組和NT組的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=1.472、1.185，均P＞0.05）。EH組NFKB1基因rs28362491位點DD基因型頻率高于NT組，Ⅱ、ID基因型頻率低于NT組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩組D、I等位基因頻率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩組隱性模型（DD比ID+Ⅱ）分布差異有統計學意義（P＜0.05），但兩組顯性模型（ID+DD比Ⅱ）分布差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組NFKB1基因rs28362491位點基因多態性分布[例（%）]

2.4 EH危險因素的logistic回歸分析 將是否患有EH作為因變量，EH相關危險因素如年齡、吸煙、飲酒、BMI、糖尿病、TG、TC及NFKB1基因 rs28362491位點DD基因型作為自變量。在校正吸煙、飲酒、BMI、高血壓等因素后，DD基因型仍是EH的獨立危險因素（OR=1.729，95%CI：1.135～3.926，P＜0.05），見表3。

表3 EH危險因素的logistic回歸分析

2.5 兩組對象及不同基因型者TNF-α水平比較 ET組血清TNF-α水平為（3.22±0.83）pg/ml，高于NT組的（2.75±0.84）pg/ml，差異有統計學意義（P＜0.01）。DD基因型對象血清TNF-α水平為（3.51±0.91）pg/ml，高于Ⅱ+ID基因型對象的（3.24±0.78）pg/ml，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

EH是常見的慢性疾病之一，中國18歲及以上的居民發病率約27.9%，且患病率仍呈升高趨勢[9]。長期EH易并發心、腦、腎等血管疾病，且EH目前無法治愈，已成為影響人類健康的公共衛生問題。因此，對高血壓發病機制的研究并制定相應的治療對策是近年來研究熱點[10]。國內外研究證實，炎癥與EH的發生、發展及轉歸密切相關[11]。NF-κB是一種重要的多功能核轉錄調控因子，其介導信號通路是炎癥反應的調節中樞[12]。激活的NF-κB能使下游炎癥相關因子如TNF-α、IL-8過度表達，一方面，這些炎癥因子誘導血管壁產生炎癥反應，刺激血管平滑肌細胞的增殖，進而生血管重塑，最終促進血壓升[13]；另一方面，這些細胞因子對NF-κB的正反饋，可進一步活化NF-κB，造成持續或放大的炎癥反應來調節炎癥因子的表達[14]。

NF-κB是由 p65（RelA）、c-Rel、RelB、NFKB1（p50/p105）、NFkB2（p52/p100）組成，其中 NFKB1基因編碼的p50蛋白常以p50/p65異源二聚體和p50/p50同源二聚體兩種結合形式發揮功能[15]，影響NF-κB信號通道表達。p50/p65異源二聚體是人體內最常見且含量最豐富的二聚體，可通過增加炎癥細胞因子的轉錄而具有促炎癥性質，例如TNF-α和IL-12，而p50/p50同型二聚體通過刺激抗炎細胞因子的轉錄具有抗炎作用，例如IL-10[16]。rs28362491位點是NFKB1基因中唯一具有表達功能的SNP，表現為ATTG堿基的插入/缺失，編碼Ⅱ、ID、DD 3種基因。既往研究表明，在不同人群中，攜帶NFKB1基因rs28362491 D等位基因或DD基因型的攜帶者體更易患慢性炎癥性疾病，如冠心病、腫瘤、系統性紅斑狼瘡[17-18]，但與EH相關性研究不多。本研究探討NFKB1-94ins/del ATTG基因多態性在EH人群的分布，結果顯示EH組NFKB1基因rs28362491位點DD基因型和D等位基因分布頻率顯著高于NT組；在校正其它危險因素后，攜帶DD基因型人群EH發病風險增加1.729倍，提示D等位基因可能是EH發生的遺傳易感基因，但具體發病機制仍不明確。

TNF-α是重要的促炎因子，通過內皮功能破壞和平滑肌細胞增殖，產生的氧自由基可直接使平滑肌收縮或間接使內皮依賴性舒張因子失活，增加收縮血管效應，與高血壓病的發生、發展密切[19]。NFKB1作為NF-κB蛋白家族組成部分，與炎癥反應介質關系密切。本研究結果證明，EH組患者血清TNF-α水平明顯高于NT組，此外，NFKB1-94ins/del ATTG DD基因型攜帶者的血清TNF-α水平高于ID基因型和Ⅱ基因型。筆者推測，NFKB1-rs28362491位點ATTG缺失（等位基因D），影響NF-κB轉錄效率，p50蛋白合成減少，引起p50/p65異源二聚體和p50/p50同源二聚體失衡，刺激TNF-α的產生，最終使機體處于炎癥過度表達的狀態。

綜上所述，NFKB1基因rs28362491位點多態性是EH的獨立危險因素，D等位基因可能通過調節血清TNF-α的水平成為易感等位基因，影響EH的發生、發展。本研究存在一定的局限性：EH是一種多基因疾病，需進行基因-基因交互作用以及基因-環境交互作用方面的研究；本研究樣本量少，為橫斷面研究，不能像隊列研究一樣預測因果關系；NFKB1基因調節多種炎性細胞因子，本研究僅觀察TNF-α，今后還需進一步擴大炎癥因子范圍深入研究。