消退素D2對CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心肌細胞凋亡的保護作用及機制研究

石哲瑋 錢彩珍 劉勝新 秦鋮璠 宣婧婧

病毒性心肌炎是一種由病毒感染引起的心臟炎癥性疾病[1]。自然界內幾乎所有的病毒感染都可引起病毒性心肌炎，其中以呼吸道和腸道病毒最為多見。柯薩奇B3病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）引起心肌炎約占所有病毒的40%～45%。由于目前臨床上缺乏有效的治療手段，所以暴發性心肌炎患者的死亡率仍較高[2]。尋找能夠有效緩解病毒感染引起心臟損傷的藥物有望降低病毒性心肌炎患者的死亡率。細胞凋亡被認為是一種由基因調控的細胞自主、有序的死亡模式，其已被證明參與了病毒性心肌炎的發生、發展過程[3]。同時，細胞凋亡程度與病毒性心肌炎小鼠的預后具有相關性。抑制CVB3感染引起的心肌細胞凋亡可減輕病毒性心肌炎小鼠的心肌損傷并改善心肌重構[4]。

消退素是一類具有促進機體內炎癥消退作用的多不飽和脂肪酸衍生物[5]。D類消退素（Resolvin D,RvD）是消退素家族的重要組成部分。既往研究表明，RvD1可抑制內質網應激誘導的細胞凋亡[6]；同時，RvD1可抑制氧化應激損傷誘導的細胞凋亡從而減弱巨噬細胞的胞吞作用[7]。本研究通過檢測RvD2治療后病毒性心肌炎小鼠心肌組織凋亡程度和凋亡相關通路蛋白磷酸化水平以明確RvD2對心肌細胞凋亡的調控作用，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和動物 CVB3 Nancy株由美國ATCC公司提供，所用Hep2細胞經由中國科學院上海生科院細胞資源中心鑒定并提供。本研究通過向體外培養的Hep2細胞的培養基中加入CVB3病毒從而使CVB3活化增殖。待CVB3病毒造成75%的Hep2細胞損害時收集病毒，測定CVB3病毒滴度并稀釋至107TCID50/0.1 ml[8]。雄性BALB/c小鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2012-0002］，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心［SYXK（浙）2015-0009］。

1.2 實驗試劑及儀器 RvD2購自美國Cayman chemical公司（批號：10007279，規格：50 μg）；SC66購自美國MCE公司（批號：HY-19832，規格：5 mg）；兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；批號：#5174，規格：100 μl）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase,AKT；批號：#4685，規格：100 μl）、p-AKT（批號：#4060，規格：100 μl）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3；批號：#9662，規格：100 μl）、B 淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號：#3498，規格：100 μl）和Bcl-2關聯X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax；批號：#14796，規格：100 μl）單克隆抗體均購自美國CST公司；山羊抗兔IgG抗體（批號：BS13278，規格：100 μl）購自美國Bioworld公司；病理染色試劑盒（批號：G1120，規格：100 ml）、蛋白濃度檢測試劑盒（批號：PC0020，規格：50T）購自北京Solarbio公司；Multiskan SkyHigh酶標儀購自美國賽默飛公司；BX43生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒性心肌炎動物模型構建 雄性BALB/c小鼠40只，通過隨機數字表法分為正常對照組、病毒性心肌炎組、RvD2治療組、AKT抑制劑處理組，每組10只。正常對照組小鼠予腹腔注射0.2 ml、0.9%氯化鈉溶液作為對照。其余3組小鼠均腹腔接種含1.0×106滴度的CVB3病毒液0.2 ml，構建病毒性心肌炎動物模型；腹腔接種CVB3 6 h后，予RvD2治療組小鼠腹腔注射RvD2 0.25 ng·g-1·d-1，AKT抑制劑處理組小鼠腹腔注射 RvD2 0.25 ng·g-1·d-1和 AKT 抑制劑 5 μg·g-1·d-1。藥物處理7 d后處死4組小鼠，留取心臟組織和血清標本。

1.3.2 小鼠心肌組織病理染色及評分 將正常對照組、病毒性心肌炎組、RvD2治療組小鼠心尖部心肌組織固定于4%多聚甲醛中。24 h后，沖洗殘留的多聚甲醛。脫水、石蠟包埋后制成含心肌組織的蠟塊，HE染色。由資深的病理科醫師對各組小鼠心肌組織中炎癥細胞分布情況進行評分：0分為無炎癥細胞浸潤；1分為浸潤面積0～＜25%，2分為浸潤面積25%～＜50%,3分為浸潤面積50%～＜75%；4分為浸潤面積75%～100%。

1.3.3 小鼠血清肌鈣蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和B型腦鈉肽（brain natriuretic peptide,BNP）水平檢測采用ELISA法。將所取血液樣本室溫放置1 h，靜待血液凝固后將其放入離心機中，在4℃溫度下2 000 r/min、離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒步驟檢測小鼠血清cTnI和BNP水平。

1.3.4 小鼠心肌組織p-AKT、AKT及凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2水平檢測 采用Western blot法。將蛋白裂解液和小鼠心肌組織一同加入組織勻漿管中，將組織攪碎并在低溫環境下靜置30 min。以12 000 r/min離心30 min，取上清液，測定總蛋白水平。將所配得的蛋白體系通過10%分離膠跑開后，在300 mA恒定電流的條件下轉膜90 min，用5%脫脂奶粉封閉 2 h，加入一抗 p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）和Bcl-2（1∶1 000）在4℃冰箱中孵育過夜。第2天取出孵育盒，TBS-Tween洗滌3次，10 min/次，在相應的二抗中孵育2 h，再次用TBS-Tween洗3次，曝光、顯影。通過Image J軟件分析灰度值，p-AKT蛋白以AKT蛋白條帶作參照，Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達量與GAPDH蛋白量作比較。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠心臟組織炎癥反應評分比較 與正常對照組炎癥反應評分比較（0分），病毒性心肌炎組評分[（2.7±0.5）分]升高（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組比較，RvD2治療組評分[（1.3±0.5）分]降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組小鼠心肌組織形態學觀察及炎癥反應評分比較（HE染色，×200）

2.2 3組小鼠血清cTnI和BNP水平比較 與正常對照組比較，病毒性心肌炎組小鼠血清cTnI、BNP水平均增加（均P＜0.05）；而與病毒性心肌炎組比較，RvD2治療組小鼠血清cTnI、BNP水平均降低（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠血清cTnI和BNP表達水平比較（pg/ml）

2.3 3組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比較 與正常對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax水平增加，而Bcl-2水平降低（均P＜0.05）；與病毒性心肌炎組相比，RvD2治療組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax水平降低，而Bcl-2水平增加（均P＜0.05），見圖2。

圖2 3組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax和Bcl-2水平比較

2.4 3組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平比較 與正常對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織內AKT蛋白磷酸化水平上調（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組相比，RvD2治療組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平上調（P＜0.05），見圖3。

圖3 3組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平比較

2.5 4組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平和Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比較 AKT抑制劑處理組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平較RvD2治療組下調（P＜0.05），Caspase-3、Bax水平較RvD2治療組增高，而Bcl-2水平降低（均P＜0.05），見圖4。

圖4 4組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平和Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較

3 討論

病毒性心肌炎在我國青少年和40歲以下成年人中多發，是青年患者心源性猝死的重要病因之一[9]。病毒性心肌炎的發病人數表現為逐年上升的趨勢，已威脅各國青少年的生命健康。因此，尋找能夠有效抑制病毒感染引起的心肌炎癥和心臟損傷的藥物對病毒性心肌炎患者的治療具有重要價值。

本課題組前期研究發現RvD2可有效減輕病毒性心肌炎小鼠的炎癥反應，本研究進一步闡明了RvD2在病毒性心肌炎小鼠體內對心肌組織凋亡的抑制作用。細胞凋亡被認為是一種細胞的程序性死亡。由于心肌細胞是人體內的一種不可再生細胞，所以隨著心肌細胞死亡數量的增加，心臟功能受到顯著影響。既往研究表明，通過抑制心肌組織凋亡可發揮心臟保護作用。Sang等[10]的研究表明褪黑素可通過調節心肌細胞凋亡和自噬來減少CVB3感染引起的心肌損傷；Liu等[11]的研究表明給予病毒性心肌炎小鼠黃芪甲苷Ⅳ治療可減少心肌細胞凋亡，從而減少小鼠的死亡率。本研究通過ELISA法檢測了小鼠血清中cTnI、BNP水平，Western blot法檢測了小鼠心肌組織內Caspase-3、Bcl-2和Bax水平。結果表明RvD2可降低病毒性心肌炎小鼠血清中cTnI、BNP水平，同時降低心肌組織中Caspase-3、Bax水平，增加Bcl-2水平。由此可見，RvD2可有效減少CVB3誘導的心肌損傷，同時抑制病毒性心肌炎小鼠心肌組織凋亡，從而發揮其心臟保護作用。

為了進一步闡明RvD2在調控病毒性心肌炎小鼠心肌組織凋亡過程中的信號轉導機制，本研究通過Western blot法檢測凋亡相關通路蛋白磷酸化水平。既往研究表明，PI3K/AKT通路在細胞凋亡的調控過程中發揮重要作用[12]。Zhang等[13]的研究結果表明RvD2對AKT蛋白磷酸水平具有顯著的上調作用。本研究結果表明，在病毒性心肌炎小鼠體內RvD2可上調心肌組織內AKT蛋白的磷酸化水平。在給予AKT抑制劑處理后，RvD2對AKT蛋白磷酸化水平的上調作用受到顯著抑制，Caspase-3、Bax水平上調，Bcl-2水平下調。由此可見，RvD2可通過調控AKT信號通路影響心肌組織凋亡水平。

綜上所述，本研究結果表明腹腔注射RvD2治療可有效抑制病毒性心肌炎小鼠血清中cTnI、BNP水平，減少心肌組織內凋亡相關蛋白水平，抑制心肌組織凋亡的發生，通過抑制AKT蛋白磷酸化水平可逆轉RvD2的抗凋亡作用。本研究證明RvD2可通過激活AKT信號通路降低心肌細胞凋亡程度，從而改善病毒性心肌炎小鼠的癥狀并降低其死亡率，預期可為病毒性心肌炎提供新的治療藥物。

但本研究也存在不足之處。首先，對心肌細胞凋亡的檢測方法較為單一，后續可增加熒光染色技術，從而更加全面評估心肌細胞凋亡情況；其次，對于信號調控通路的研究尚不全面，后續可增加對AKT上下游蛋白的檢測，從而更好地闡明RvD2的抗凋亡機制。