小分子熱休克蛋白HSPB1通過上調SIRT1減輕H2O2誘導的人血管內皮細胞早衰*

侯常苗，劉更盛，蔣宇，劉艷娟，鄒聯洪，陳芳，劉協紅△

［1湖南省人民醫院（湖南師范大學附屬第一醫院），湖南省急救醫學研究所，急危重癥代謝組學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410005；2湖南中醫藥大學臨床醫學院，湖南省腦科醫院，湖南 長沙 410007；3益陽市中心醫院，耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 益陽 413099］

動脈粥樣硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）包括中風、心肌梗死和心源性猝死，是目前全球發病率和死亡率的主要原因之一［1］。ASCVD的患病率與血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）早衰引起功能障礙有關。血管內皮功能障礙會降低細胞的抗凝、抗增殖、抗炎和血管舒張過程，從而導致ASCVD風險增加［2］。血管內皮細胞的功能對于內皮屏障功能至關重要，其可維持血管穩態［3］。同時，功能性黏附分子可以支持和控制血管內皮連接的完整性［4］。但目前對血管內皮細胞功能的調控機制，內皮細胞衰老對血管功能的影響及其相關分子機制仍不清楚。

細胞可以通過由內在和外在應激因素引起的DNA損傷進入衰老狀態，稱為應激誘導的過早衰老（stress-induced premature senescence，SIPS）［5］。衰老細胞的特征是細胞形態的改變、DNA損傷、細胞周期負調控因子p16和p21陽性及衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）活性增加［6-7］。其中，氧化應激引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的變化是導致SIPS的主要因素［8］。持續的高ROS水平可導致細胞大分子損傷、內皮功能受損，從而通過激活氧化應激反應導致衰老，進而促進動脈粥樣硬化的發展［9］。

HSPB1是最先在人類細胞中發現的相對分子質量為27 kD（大鼠為25 kD）的小分子熱休克蛋白，又稱為HSP27（或HSP25）［10］。大量研究證實HSPB1在細胞的氧化應激損傷，如缺血再灌注損傷和腦缺血損傷中發揮了保護作用［11-12］。HSPB1可通過增加葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）的活性使谷胱甘肽（glutathione，GSH）保持還原狀態從而減少ROS的產生［13］。以上研究提示，HSPB1在調控氧化應激水平中具有重要作用。但是，HSPB1是否通過調控氧化應激減緩血管內皮細胞衰老有待進一步研究。

本研究探討HSPB1在H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）早衰中的作用及其機制。我們假設HSPB1參與抑制內皮細胞衰老和調節沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表達，從而減輕了內皮細胞的功能障礙。本研究結果可能會揭示內皮細胞衰老的機制，并有助于確定動脈粥樣硬化和其它與衰老相關疾病的潛在治療靶點。

材料和方法

1 主要材料

源自ATCC的HUVECs購于上海拜力生物科技有限公司。DMEM培養液和胎牛血清均（Gibco）；H2O2（Sigma）；Lipofectamine 2000（Invitrogen）；無內毒素質粒提取試劑盒（CWBIO）；熒光定量檢測試劑盒和第一鏈合成試劑［天根生化科技（北京）有限公司］；Total RNA Extraction Kit（Promega）；SA-β-Gal染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；抗SIRT1抗體、抗p53抗體、抗p16抗體、抗p21抗體、抗γH2AX抗體和抗β-actin抗體（Affinity）。

2 主要方法

2.1 實驗分組及干預方法根據文獻建立H2O2誘導的HUVECs SIPS模型［12］。細胞群倍加數（cell population doubling level，PDL）是指從培養開始至現在細胞群的倍增次數。將PDL8 HUVECs隨機分為空白對照（control）組、H2O2處理組和H2O2+HSPB1過表達組，觀察HSPB1對H2O2誘導的HUVECs早衰的影響。將PDL8 HUVECs分為對照（control）組、H2O2處理組、H2O2+HSPB1過表達組、H2O2+SIRT1siRNA組和H2O2+SIRT1siRNA+HSPB1過表達組，觀察HSPB1是否通過SIRT1調控內皮細胞早衰。

2.2 SA-β-Gal活性測定根據試劑盒操作流程檢測SA-β-Gal活性。簡單地說，HUVECs在磷酸鹽緩沖液中清洗3次，用固定液在室溫下固定15 min，然后在37℃下與新鮮的SA-β-Gal染色溶液在pH 6.0下孵育過夜。通過計數200個細胞樣本中陽性染色的細胞（×200）來計算SA-β-Gal的百分比。

2.3 流式細胞術檢測細胞內ROS水平用2"，7"-二氯熒光素二乙酸酯（2"，7"-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）測定ROS水平。將培養的HUVECs接種于6孔板中，轉染pCMV-c-Myc-HSPB1質粒，加入50μmol/L H2O2作用48 h后，收集細胞，用10μmol/L DCFH-DA在37℃孵育30 min，用流式細胞儀進行檢測。

2.4 RT-qPCR檢測p16和p21的mRNA表達將HUVECs用Trizol裂解，提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉成cDNA，操作按試劑盒說明書進行，再用TB Green?Premix Ex TaqTM進行檢測。反應程序為：95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環。引物由上海生工生物公司合成，序列見表1。以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt法對p16和p21 mRNA表達進行相對定量分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.5 Western blot檢測蛋白表達收集細胞分別提取總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白后轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌3次后，加入Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST振蕩洗滌后，ECL發光顯色，ChemiDoc?成像系統（BLM Biotechnology）掃描分析。使用ImageJ軟件（NIH）對條帶進行量化。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件進行圖形繪制和統計學分析。至少3個獨立數據集的結果，表示為均數±標準差（mean±SD）。對于統計分析，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HSPB1對H2O2誘導HUVECs的早衰的影響

50μmol/L H2O2作 用 于PDL8的HUVECs 48 h后，p16和p21的mRNA表達水平顯著升高，而過表達HSPB1可顯著降低p21和p16的mRNA水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖1A、B。同時，如圖1C所示，H2O2作用HUVECs后，SA-β-Gal活性顯著增加，衰老細胞數由對照組的（15.97±2.18）%增加到H2O2處理后的（74.1±3.19）%（P＜0.01），同時細胞形態變扁平，細胞面積顯著增加；而與H2O2處理組比較，過表達HSPB1可顯著減少H2O2誘導的衰老細胞數（P＜0.01），維持細胞正常的形態。另外，HUVECs經H2O2處理后，ROS水平較基礎水平顯著升高（P＜0.01）；而轉染HSPB1過表達質粒后，ROS水平較基礎水平顯著降低（P＜0.01）；同時，與H2O2處理組比較，過表達HSPB1顯著降低了H2O2引起的ROS水平（P＜0.01），見圖1D。

2 HSPB1對H2O2誘導的HUVECs中早衰相關分子及黏附分子表達的影響

為探討HSPB1延緩HUVECs衰老的機制，采用Western blot法觀察與早衰相關蛋白p53及周期素依賴性蛋白激酶抑制分子（p21和p16）的表達。如圖2A所示，與對照組比較，H2O2處理顯著提高p53、p21和p16的蛋白水平（P＜0.01）；而HSPB1過表達可部分逆轉H2O2誘導的p53、p21和p16的增高（P＜0.05或P＜0.01）。同時，過表達HSPB1可降低H2O2誘導的黏附分子VCAM-1與ICAM-1的表達（P＜0.01），見圖2B。

Figure 1.HSPB1 delayed H2O2-induced HUVEC senescence.A and B：after PDL8 HUVECs were transfected with 2μg pCMV-c-Myc-HSPB1 for 24 h and then treated with H2O2 for 48 h，the mRNA expression of p16 and p21 in HUVECs was detected by RT-qPCR；C：senescence-associatedβ-galactosidase（SA-β-Gal）staining of HUVECs（scale bar=20μm）；D：the reactive oxygen species（ROS）levels were detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2 group.圖1 HSPB1延緩H2O2誘導的HUVECs衰老

Figure 2.HSPB1 decreased the expression of senescence-related molecules and adhesion molecules in H2O2-induced HUVECs.The PDL8 HUVECs were transfected with 2μg pCMV-c-Myc-HSPB1 for 24 h and then treated with H2O2 for 48 h.A：the protein levels of p53，p21 and p16 were detected by Western blot；B：the protein levels of vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）and intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2 group.圖2 HSPB1降低H2O2誘導的HUVECs衰老相關分子及黏附分子的表達

3 沉默SIRT1可阻斷HSPB1減緩HUVECs早衰的作用

為了進一步探討SIRT1是否是HSPB1調控SIPS的關鍵因子，我們用SIRT1siRNA沉默HUVECs中的SIRT1基因，觀察p16和p21 mRNA表達、DNA損傷標志物γH2AX蛋白水平及SA-β-Gal活性，檢測SIRT1基因沉默對HSPB1延緩HUVECs衰老作用的影響。如圖3A所示，與未轉染組比較，SIRT1siRNA轉染組的SIRT1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），干擾效率達70%。在H2O2誘導的HUVECs中，與H2O2單獨處理組比較，H2O2+SIRT1siRNA組中p16和p21的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01），H2O2+CMV-c-Myc-HSPB1組中p16和p21的mRNA水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而H2O2+SIRT1siRNA+CMV-c-Myc-HSPB1組p16和p21的mRNA表達水平無顯著差異，見圖3B、C。Western blot結果顯示，在H2O2誘導的HUVECs中，SIRT1siRNA逆轉了pCMV-c-Myc-HSPB1引起的γH2AX蛋白水平下降（P＜0.05），見圖3D。同時，如圖3E所示，與H2O2處理組比較，H2O2+SIRT1siRNA組衰老細胞的數量顯著增加（P＜0.01）；與H2O2+CMV-c-Myc-HSPB1組比較，H2O2+SIRT1siRNA+CMV-c-Myc-HSPB1組衰老細胞的數量顯著增加（P＜0.01）。

另外，如圖4A所示，與H2O2+CMV-c-Myc-HSPB1組比較，H2O2+SIRT1siRNA組和H2O2+SIRT1siRNA+CMV-c-Myc-HSPB1組中p53和p21蛋白表達均顯著增高（P＜0.01）。而我們也觀察到沉默SIRT1可逆轉HSPB1對p16的下調作用（P＜0.01），見圖4B。

討 論

Figure 3.Transient transfection of SIRT1 siRNA abrogated the anti-senescence effect of HSPB1 in HUVECs.A：the efficiency of SIRT1 siRNA transfection was detected by Western blot.The HUVECs were treated with pCMV-c-Myc-HSPB1 and/or SIRT1 siRNA for 48 h，followed by treatment with H2O2 for 24 h.B and C：the mRNA expression levels of p16（B）and p21（C）in HUVECs were detected by RT-qPCR；D：the protein level ofγH2AX was detected by Western blot；E：senescence-associatedβ-galactosidase（SA-β-Gal）staining of HUVECs（scale bar=20μm）.Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs control group；▲▲P＜0.01 vs negative group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs H2O2 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2+CMV-c-Myc-HSPB1 group.圖3 瞬時轉染SIRT1 siRNA逆轉HSPB1在HUVECs中的抗衰老作用

血管衰老相關的主要不良心血管事件是敗血癥幸存者和有心血管風險的老年人的一個潛在特征。在這些患者中，加速血管衰老可能是潛在的促進機制之一［14-16］。SIPS經常被用作研究衰老的模型，因為它具有衰老細胞的特征，如DNA氧化損傷水平增加、端粒縮短加速和細胞周期調節的改變［17-18］。有研究表明，H2O2預處理HUVECs后炎癥因子分泌增多，氧化應激增加，即H2O2通過誘導慢性炎癥和氧化應激促進細胞衰老［18］。本實驗表明，經H2O2處理后，HUVECs的SA-β-Gal活性顯著增加，細胞形態發生改變，ROS水平升高，說明H2O2誘導的HUVECs氧化應激引起衰老模型構建成功。

Figure 4.HSPB1 attenuated H2O2-induced senescence of HUVECs through SIRT1/p53/p21 and SIRT1/p16 pathways.The HUVECs were treated with pCMV-c-Myc-HSPB1 and/or HSPB1 siRNA for 48 h，followed by treatment with H2O2 for 24 h.A：the protein levels of p53 and p21 were detected by Western blot；B：the protein level of p16 was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs H2O2 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2+CMV-c-Myc-HSPB1 group.圖4 HSPB1通過SIRT1/p53/p21及SIRT1/p16途徑減輕H2O2誘導的HUVECs衰老

HSPB1的生物學功能是保護細胞免受環境中的自由基、熱、缺血和有毒物質等各種應激因素的影響。此外，HSPB1還參與細胞增殖、分化和凋亡的信號轉導和調控［19］。有研究探討了嚙齒動物中分子伴侶在與年齡相關的蛋白質之間的關系，結果顯示在嚙齒動物肌肉和肝臟中長壽蛋白和HSPB1蛋白質表達水平之間具有最佳擬合線性回歸［20］。同時，裸鼴鼠（最低壽命31年）中在腦、肺和腎組織中HSPB1的表達比其他小鼠高2～10倍［21］。細胞內p53和p21蛋白水平的升高被認為是內皮細胞衰老的功能標志［22］，這是由p53介導的細胞周期停滯導致的，在衰老相關的DNA損傷和端粒功能障礙中p21的表達增加［15，23］。在本研究中，過表達HSPB1可減輕H2O2誘導的p53、p21、VCAM1和ICAM-1蛋白水平升高，這說明HSPB1可以保護HUVEC免受氧化損傷相關的過早衰老，提示HSPB1在血管老化和氧化環境改變引起的疾病中具有保護作用。

SIRT1是一種脫乙酰酶，可通過增加內皮一氧化氮的產生、減少炎癥和氧化應激以及誘導自噬等不同機制，在防止血管衰老和動脈粥樣硬化方面發揮重要作用［24］。人參皂苷Rb1可通過調控SIRT1相關通路延緩HUVECs的衰老［25］，而硫化氫可通過上調SIRT1抵抗高糖誘導的HUVECs衰老［26］。SIRT1可通過p53/21或p16途徑參與細胞的生長、分化和衰老等生理和病理過程［27］。在阿霉素誘導的H9c2細胞損傷中，HSPB1通過SIRT1調控p53乙酰化，繼而減輕細胞的凋亡［28］。同時，我們以上結果提示，HSPB1可能通過SIRT1途徑延緩了HUVECs氧化應激誘導的早衰。為了證實我們的假說，我們利用小分子干擾片段沉默了SIRT1基因的表達，HSPB1對H2O2誘導的HUVECs的早衰和DNA損傷保護作用減弱，表明HSPB1的抗衰老作用依賴SIRT1信號通路。

綜上所述，我們的研究表明，HSPB1可通過調節SIRT1/p53/p21及SIRT1/p16信號途徑保護HUVECs免受H2O2誘導的過早衰老，這提示HSPB1作為一種潛在的治療靶點來延緩血管衰老和預防包括動脈粥樣硬化在內的與年齡相關的血管疾病。但本實驗存在一定的局限性，僅在HUVECs中進行研究，并沒有在整體動物模型或原代血管內皮細胞中進行探討，還需要在后續實驗中進行驗證。