NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對體外氧糖剝奪/復氧損傷少突膠質細胞的保護作用*

趙富生，陳君，楊國宏，符禹玄，張可心，李媛媛，武庚

（牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157000）

腦卒中又稱中風，是一種常見的急性腦血管疾病。在我國每年約150萬～200萬病人死于腦血管疾病，死亡率為149.49/10萬人，其中大約80%為缺血性腦卒中［1］。腦缺血/再灌注損傷是缺血性腦卒中的關鍵環節，其病理機制與氧化應激、炎癥和興奮性毒性等因素有關［2］。少突膠質細胞是腦白質的重要組成細胞，對神經元具有支持、營養、保護和形成髓鞘等多種功能，對低灌注非常敏感，極易發生缺血缺氧損傷［3］。因此，探尋有效的干預措施阻止或改善缺血/再灌注導致的少突膠質細胞損傷具有重大意義。

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的非造血干細胞，具有取材方便，易于擴增，分泌包括外泌體在內的多種細胞因子，并能穩定表達外源基因等優點，因而被用于修復缺血性損傷和組織缺損［4-5］。在腦卒中大鼠模型中，通過尾靜脈注射BMSCs可減輕血腦屏障滲漏，促進血管形成，減小腦梗死面積，改善大鼠神經功能［6］。經腹主動脈移植BMSCs可通過增加損傷部位血管內皮生長因子含量，進而介導其下游磷脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信號通路促進脊髓缺血再灌注損傷大鼠后肢功能恢復［7］。PI3K/AKT信號通路在細胞增殖、分化、遷移、凋亡及炎癥反應等多種病理生理過程中發揮重要調節作用［8］。有研究報道，神經調節蛋白1（neuregulin 1，NRG1）通過激活PI3K/AKT通路減輕膿毒癥引起的大鼠膈肌萎縮［9］。體外研究顯示，NRG1通過激活PI3K/AKT通路促進耳蝸核神經干細胞向神經元和神經膠質細胞分化，抑制細胞凋亡［10］。NRG1是一種含表皮生長因子樣結構域的跨膜蛋白，參與神經細胞發育、髓鞘形成、突觸塑型以及神經受體表達，在神經系統發育過程中發揮重要作用［11］。研究表明，NRG1通過與其受體ErbB2、ErbB3和ErbB4結合，形成同源或異二聚體，激活細胞內酪氨酸激酶，參與調控少突膠質細胞增殖和分化［12］。有研究報道，鞘內注射NRG1蛋白能夠減輕炎癥反應，減少硫酸軟骨素聚糖蛋白生成，抑制膠質瘢痕形成，促進大鼠神經功能恢復［13］。將NRG1基因過表達的脂肪基質干細胞注射到大鼠紋狀體，可通過NRG1-ErbB4通路促進MAPK磷酸化，減小腦梗死面積，改善腦卒中大鼠神經功能［14］。我們的前期研究表明，NRG1基因過表達施萬細胞通過上調ErbB2和ErbB4表達，促進神經元存活，改善脊髓損傷大鼠肢體運動功能［15］。然而，上調BMSCs中NRG1的表達，能否提升BMSCs對氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）所致少突膠質細胞損傷的保護作用，目前尚未見報道。因此，本研究擬構建少突膠質細胞OGD/R模型，體外觀察NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對少突膠質細胞OGD/R損傷的保護作用，并探討其可能機制，旨在為腦卒中治療提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 動物1月齡SPF級SD大鼠6只，雌雄各半，體重90～100 g，由牡丹江醫學院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（黑）2019-003。

1.2 細胞大鼠少突膠質前體細胞系CG4購自上海淳麥生物科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器pcDNA3.1（+）-NRG1-IRES/eGFP質粒（廣州賽業生物科技有限公司）；Transwell（Corning）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）、calcein/PI染色試劑盒、衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；ELISA試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）；Fu-Gene6轉染試劑（Promega）；抗p21、p53、PI3K和AKT抗體（Proteintech）；抗p-PI3K和p-AKT抗體（Abcam）。ELx800酶標儀（BioTek）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon）；MIC-101細胞缺氧氣室（Billups-rothenberg）。

2 方法

2.1 BMSCs分離培養頸椎脫臼處死大鼠，在無菌條件下分離股骨和脛骨，用10 mL DMEM沖洗骨髓腔，經200目無菌篩網過濾沖洗液，接種于50 mL培養瓶中，常規培養72 h后更換培養液，當細胞匯合達80%～90%時，進行傳代培養［16］。

2.2 NRG1質粒轉染BMSCs取第3代BMSCs按1×108/L、每孔2 mL接種于6孔板中，分為對照（BMSCs）組、空質粒轉染BMSCs（empty vector-BMSCs）組和NRG1質粒轉染BMSCs（NRG1-BMSCs）組。按照Fu-Gene6轉染試劑說明書用NRG1質粒和空載質粒分別轉染BMSCs，具體操作參照文獻進行［13］。轉染24 h和72 h，收集各組BMSCs，按照ELISA試劑盒說明測定各組細胞裂解液和培養液中NRG1蛋白含量。

2.3 OGD/R模型建立和實驗分組取CG4細胞更換無糖DMEM培養液，置于缺氧培養氣室中，通入混合氣體（95%N2和5%CO2）37℃培養2 h，更換完全培養液，37℃、5% CO2培養箱中復氧復糖培養22 h，建立OGD/R細胞模型［17］。BMSCs（1.5×108/L）或NRG1-BMSCs（1.5×108/L，轉染72 h）與OGD/R處理CG4細胞（1.5×108/L）在Transwell中共培養。將實驗分為4組：對照（control）組，CG4細胞常規培養24 h；OGD/R組，OGD/R處理CG4細胞后，常規培養24 h；BMSCs組，OGD/R處理CG4細胞后，與BMSCs常規共培養24 h；NRG1-BMSCs組，OGD/R處理CG4細胞后，與NRG1-BMSCs常規共培養24 h，進行后續實驗。采用倒置相差顯微鏡觀察CG4細胞形態學變化。

2.4 MTT實驗取各組CG4細胞，以3×107/L接種于96孔培養板，每孔100μL，培養24 h，加MTT工作液（每孔10μL），孵育4 h后棄培養液，加100μL DMSO，酶標儀在570 nm波長處測定吸光度（A）。細胞活力（%）=（樣品平均A值-空白孔平均A值）/（對照組平均A值-空白孔平均A值）×100%。

2.5 細胞劃痕實驗取各組CG4細胞，以5×108/L接種于6孔培養板，培養24 h，用20μL吸頭垂直于培養皿底部水平劃痕（0 h），繼續培養24 h，顯微鏡下觀察細胞分布并采集圖像。采用ImageJ軟件測量劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

2.6 氧化應激檢測取各組CG4細胞，應用DHE熒光探針檢測各組CG4細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，采用硫代巴比妥酸法測定CG4細胞裂解液中MDA含量，通過比色法檢測CG4細胞內總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）水平，實驗操作均按照試劑盒說明書進行。

2.7 細胞衰老檢測取各組CG4細胞，室溫固定，加1 500μL SA-β-Gal染色工作液，光鏡下觀察拍照。各組隨機選取6個視野，計算陽性細胞率并求均值。陽性細胞率（%）=陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.8 細胞死亡率檢測參照文獻［18］，采用calcein/PI雙染法檢測細胞存活情況。紅色熒光代表PI染色細胞，為死亡細胞，綠色熒光代表calcein染色細胞，為存活細胞。取各組CG4細胞，接種于鋪有玻片6孔培養板，培養24 h，加calcein/PI染色工作液，37℃避光孵育30 min，收集CG4細胞玻片，激光共聚焦顯微鏡采集圖像。采用ImageJ分析細胞死亡率。細胞死亡率（%）=PI陽性細胞數/（calcein陽性細胞數+PI陽性細胞數）×100%。

2.9 LDH漏出率檢測參照文獻［19］操作。取各組CG4細胞，接種于96孔板中，對照組選取6孔加20μL LDH，作為樣品細胞最大酶活性對照孔，其它各組每孔加20μL細胞培養液，常規培養1 h。收集各組CG4細胞培養液離心，取120μL上清液加入到新的96孔板中，各孔加60μL LDH工作液，室溫孵育30 min，酶標儀在490 nm處測定A值。LDH漏出率（%）=（處理樣品A值-空白孔平均A值）/（細胞最大酶活性A值-空白孔平均A值）×100%。

2.1 0 Western blot檢測蛋白表達收集各組CG4細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白質濃度，變性后每孔加等量蛋白（30μg），進行凝膠電泳和轉膜。然后將PVDF膜置于5% BSA中封閉2 h，加入β-actin、衰老相關蛋白（p21和p53）和PI3K/AKT通路蛋白（p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT）抗體（均以1∶1 000的比例稀釋），4℃孵育過夜。次日加相應Ⅱ抗，37℃孵育2 h，加ECL發光試劑顯影成像，用ImageJ軟件參照β-actin分析目的蛋白條帶相對灰度值，計算目的蛋白質相對表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，結果以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BMSCs培養及NRG1質粒轉染BMSCs

細胞培養第1天，倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs呈球形、漂浮未貼壁，分布均勻；培養第3～5天，BMSCs呈多角形或長梭形，貼壁生長，形成多個散在細胞集落；傳代培養后，BMSCs排列緊密，呈束狀生長（圖1A～C）。BMSCs轉染NRG1質粒后呈現明亮綠色熒光（圖1D～F）。ELISA結果顯示，與BMSCs組相比，NRG1-BMSCs組培養液上清和細胞裂解液中NRG1蛋白含量在轉染72 h均顯著升高（P＜0.05），見圖1G、H。

Figure 1.Rat BMSCs culture and NRG1 plasmid transfection in BMSCs.A and B：morphological changes of primary BMSCs on the 1st and 3rd days observed under inverted microscope；C：morphological changes of BMSCs in the 3rd generation observed under light microscope；D and E：BMSCs transfected with pcDNA3.1（+）-NRG1-IRES/eGFP plasmid were observed under inverted and fluorescence microscope，respectively；F：overlay of light microscope image and fluorescence image（green）of NRG1-BMSCs；G and H：comparison of NRG1 protein content in culture medium and cell lysate of the BMSCs，empty vector-BMSCs and NRG1-BMSCs groups.Scale bar=200μm in A，B and C；scale bar=100μm in D，E and F.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs BMSCs group；#P＜0.05 vs empty vector-BMSCs group.圖1 大鼠BMSCs培養及NRG1質粒轉染BMSCs

2 NRG1-BMSCs對OGD/R引起的CG4細胞形態變化及活力的影響

建立CG4細胞OGD/R模型，實驗分組見圖2A。各組CG4細胞形態變化如圖2B所示，control組CG4細胞胞體透亮，呈梭形或三角形，突起細長；OGD/R組CG4細胞腫脹，胞體變暗，胞突減少；與NRG1-BMSCs共培養后，CG4細胞腫脹明顯減輕，漂浮細胞減少，細胞突起增多。MTT結果如圖2C所示，與control組相比，OGD/R組CG4細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組CG4細胞活力顯著升高（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.01）；BMSCs組與OGD/R組相比，細胞活力有所升高，但未見顯著差異（P＞0.05）。

Figure 2.Effects of NRG1-BMSCs on the morphological changes and viability of CG4 cells induced by OGD/R.A：schematic diagram of experimental grouping；B：the morphological changes of CG4 cells observed under light microscope（scale bar=100μm）；C：comparison of CG4 cell viability in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖2 NRG1-BMSCs對OGD/R引起的CG4細胞形態變化及活力的影響

3 NRG1-BMSCs對OGD/R導致的CG4細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果如圖3所示，與control組相比，OGD/R組CG4細胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組劃痕兩側細胞密度增大，空白面積明顯減少，劃痕愈合率顯著增加（P＜0.01），但仍低于對照組（P＜0.01）；BMSCs組與OGD/R組相比，劃痕愈合率增加，但未見顯著性差異（P＞0.05）。

Figure 3.Effects of NRG1-BMSCs on the migration of CG4 cells induced by OGD/R.Wound healing assay was performed，and the healing rate of the CG4 cells at 24 h in each group was determined.Scale bar=200μm.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖3 NRG1-BMSCs對OGD/R導致的CG4細胞遷移能力變化的影響

4 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞氧化應激的影響

細胞氧化應激檢測如圖4所示，與control組相比，OGD/R組CG4細胞內ROS和MDA含量顯著升高（P＜0.01），而T-AOC水平顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組CG4細胞內ROS和MDA含量顯著降低（P＜0.01），T-AOC水平顯著升高（P＜0.05），但未恢復到control組水平（P＜0.05）；BMSCs組與OGD/R組相比ROS、MDA和T-AOC水平均未見顯著性差異（P＞0.05）。

Figure 4.Effects of NRG1-BMSCs on oxidative stress in CG4 cells induced by OGD/R.A：representative DHE fluorescence staining images of CG4 cells in each group（red represented ROS，and blue represented nuclei stained with DAPI；scale bar=100μm）；B：quantitative analysis of DHE fluorescence intensity in each group；C and D：quantitative analysis of MDA content and T-AOC level in CG4 cells of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.圖4 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞氧化應激的影響

5 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞衰老的影響

細胞衰老檢測如圖5所示，與control組相比，ODG/R組CG4細胞衰老陽性率及衰老相關蛋白p21和p53水平均顯著升高（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組衰老細胞陽性率及p21和p53蛋白水平顯著降低（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.05）；BMSCs組與OGD/R組相比，CG4細胞衰老陽性率及p21和p53蛋白水平有所降低，但未見顯著差異（P＞0.05）。

6 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞死亡的影響

細胞死亡檢測如圖6A、B所示，與control組相比，OGD/R組PI陽性細胞顯著增多（P＜0.01）；與OGD/R組比，NRG1-BMSCs組PI陽性細胞顯著減少（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.01）。LDH漏出率檢測如圖6C所示，與control組相比，ODG/R組CG4細胞LDH漏出率顯著增加（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組CG4細胞LDH漏出率顯著降低（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.01）。

Figure 5.Effects of NRG1-BMSCs on CG4 cell senescence induced by OGD/R.A：representative SA-β-Gal staining images of CG4 cells in each group（scale bar=100μm）；B：quantitative analysis of SA-β-Gal positive rate of CG4 cells in each group；C and D：the protein expression levels of p21 and p53 in CG4 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖5 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞衰老的影響

7 NRG1-BMSCs對OGD/R誘 導 的CG4細 胞PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響

與control組 相 比，OGD/R組CG4細 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比 值 顯 著 降 低（P＜0.01）；與OGD/R組比，NRG1-BMSCs組CG4細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著升高（P＜0.01），但仍未恢復到control組水平（P＜0.01）；BMSCs組與OGD/R組相比，CG4細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值略有升高，但未見顯著性差異（P＞0.05），見圖7。

討 論

OGD/R細胞模型模擬了腦卒中的部分病理變化過程，是構建腦缺血/再灌注體外模型的常用方法［20］。本研究采用CG4細胞建立OGD/R模型模擬腦卒中后少突膠質細胞損傷，體外探討NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對OGD/R導致的少突膠質細胞損傷的保護作用，結果顯示NRG1-BMSCs能夠抑制OGD/R誘導的少突膠質細胞衰老以及死亡，其作用機制可能與調節PI3K/AKT信號通路，減輕細胞氧化應激有關。據我們所知，這項研究首次明確了NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對少突膠質細胞OGD/R損傷的保護作用并提出了可能的保護機制。

NRG1在神經元遷移、膠質細胞發育以及神經元和膠質細胞聯系過程中發揮重要作用［21］。本研究通過全骨髓貼壁法分離培養大鼠BMSCs，熒光顯微鏡觀察可見NRG1質粒成功轉染BMSCs。在NRG1-BMSCs培養液和細胞裂解液中，NRG1蛋白水平顯著升高且呈現時間依賴性增加。該結果提示，將NRG1-BMSCs移植到腦缺血區可能增加局部NRG1含量，一定程度上改善損傷局部微環境，促進受損神經修復。

有研究報道，BMSCs培養液通過激活PI3K/AKT信號通路減輕OGD/R導致的離體皮層神經元損傷，抑制caspase-3蛋白表達，提高神經元存活率，發揮神經保護作用［22］。本研究將NRG1-BMSCs與OGD/R處理后的CG4細胞共培養，結果表明NRG1-BMSCs能夠顯著提高CG4細胞的活力和遷移能力，提示NRG1能夠提升BMSCs對CG4細胞OGD/R損傷的保護作用。有研究報道，缺氧預處理的BMSCs可通過NRG1/PI3K/AKT信號通路促進人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移以及血管生成［23］。研究表明，將BMSCs與髓核細胞三維共培養可提高髓核細胞增殖活性，抑制β-半乳糖苷酶以及基質金屬蛋白酶9表達，減輕TNF-α誘導的髓核細胞衰老［24］。本研究結果顯示，OGD/R引起CG4細胞衰老，也可破壞CG4細胞膜導致LDH外漏，誘發CG4細胞死亡。然而，NRG1-BMSCs能夠減輕OGD/R引起的細胞膜破壞，抑制CG4細胞死亡。此外，NRG1-BMSCs能夠抑制OGD/R介導的衰老相關蛋白p21和p53表達，延緩OGD/R誘導的CG4細胞衰老和死亡。我們推測，NRG1-BMSCs神經保護作用可能與減輕OGD/R誘發的CG4細胞氧化應激有關。

Figure 6.Effects of NRG1-BMSCs on the death of CG4 cells induced by OGD/R.A：representative calcein/PI fluorescence staining images of CG4 cells in each group（red represented dead cells stained with PI，and green represented live cells stained with calcein；scale bar=100μm）；B：quantitative analysis of PI positive CG4 cells in each group；C：LDH leakage rate of CG4 cells in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖6 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞死亡的影響

研究表明，腦缺血再灌注過程中產生大量氧自由基，誘發一系列細胞反應，如線粒體損傷、脂質過氧化、細胞衰老和凋亡［25］。因此，如何有效抑制氧化應激被認為是防治OGD/R誘發腦損傷潛在的靶點。有研究報道，小檗堿預處理的BMSCs分泌液能抑制過氧化叔丁醇誘導的ROS生成，減輕氧化應激導致的離體神經元凋亡［26］。在本研究中，我們檢測了CG4細胞內ROS水平和脂質過氧化產物MDA含量，結果顯示OGD/R導致CG4細胞中ROS和MDA含量顯著增加，NRG1-BMSCs能夠減少OGD/R引起的ROS過量產生和MDA積累。該結果提示，NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的氧化應激和脂質過氧化損傷具有一定的抑制作用。此外，本研究表明，NRG1-BMSCs能夠恢復OGD/R處理后CG4細胞內T-AOC含量。這些研究結果提示，NRG1-BMSCs能夠減輕OGD/R導致的CG4細胞氧化應激，抑制ROS引起的CG4細胞衰老和死亡。PI3K是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，激活后與AKT蛋白結合，通過調節下游蛋白，參與細胞存活、生長及凋亡［27］。有研究報道，NRG1通過激活PI3K/AKT信號通路減輕膿毒癥引起的氧化應激和炎癥反應，改善大鼠膈肌功能［28］。本研究結果顯示，OGD/R抑制CG4細胞內p-PI3K和p-AKT蛋白表達。我們認為OGD/R引起的氧化應激可能抑制細胞內PI3K/AKT通路磷酸化。然而，NRG1-BMSCs能夠提高OGD/R處理后CG4細胞內PI3K和AKT磷酸化水平。因此，本研究認為PI3K/AKT信號通路參與調控OGD/R誘導的CG4細胞衰老及死亡，NRG1-BMSCs對CG4細胞的保護作用可能與PI3K/AKT信號通相關。

Figure 7.Effects of NRG1-BMSCs on the expression of PI3K/AKT signaling pathway-related proteins in CG4 cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖7 NRG1-BMSCs對OGD/R誘導的CG4細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響

綜上所述，NRG1-BMSCs能夠抑制OGD/R誘導的CG4細胞衰老和死亡，其保護作用可能與調節PI3K/AKT信號通路，減輕細胞氧化應激有關。本研究為腦卒中治療提供了新的實驗依據，但目前研究結果均為體外研究，下一步將采用動物模型深入探究NRG1-BMSCs對OGD/R損傷的修復機制。