恩格列凈對大鼠造影劑相關急性腎損傷的作用及其機制*

胡陶，王明亮，王武帥，何瀅蓉，楊曦，孫雄山，王強△

（1西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；2西部戰區總醫院心血管內科，四川 成都 610083；3西南交通大學醫學院，四川 成都 610031）

根據《中國心血管健康與疾病報告2021》，冠心病的發病率和死亡率逐年增高，隨著經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的廣泛開展，冠心病的治療取得了長足的進步，然而PCI術后較為常見的并發癥造影劑相關急性腎損傷（contrast-associated acute kidney injury，CA-AKI）的發病率一直居高不下，尤其在糖尿病合并冠心病的患者中高發，嚴重影響了患者的預后［1］。恩格列凈（empagliflozin，EMPA）屬于鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2抑 制 劑（sodium-glucose cotransporter-2 inhibitor，SGLT-2i），通過抑制腎臟對葡萄糖的重吸收，使過量的葡萄糖從尿液中排出，從而發揮降糖作用。最新一系列研究證實，恩格列凈除降低血糖外，還具有心血管保護效應，可顯著降低心力衰竭患者住院率和心血管患者死亡率等，改善了患者的預后和生存質量［2-4］。目前恩格列凈被廣泛應用于糖尿病和心血管疾病的治療，然而恩格列凈對造影劑相關急性腎損傷的作用尚不清楚。

本研究擬通過構建大鼠CA-AKI模型，觀察恩格列凈對大鼠造影劑相關急性腎損傷的防治作用，并初步探討其可能的機制，旨在為糖尿病合并冠心病患者的CA-AKI防治提供實驗參考。

材料和方法

1 動物

SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，6～8周齡，230～250 g，共40只，購自于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004，所有程序均符合機構規定，并經中國人民解放軍西部戰區總醫院倫理委員會批準。

2 主要材料

碘海醇、N-ω硝基-L-精氨酸甲酯購于MedChem-Express；吲哚美辛購于北京索萊寶科技有限公司；EMPA購于上海源葉生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購于廣州銳博生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 實驗分組及處理將40只SPF級6～8周齡雄性SD大鼠隨機分配為對照（control）組、EMPA組、CA-AKI組和CA-AKI+EMPA組。所有大鼠均在標準條件下飼養，條件為12/12 h明暗循環，濕度為50%～60%，溫度為22～24℃，并提供食物和水，適應性喂養1周。Control組大鼠適應性喂養1周后連續7 d予以生理鹽水（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；EMPA組大鼠適應性喂養1周后連續7 d予以恩格列凈（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；CA-AKI組大鼠禁水16 h，參照前期方法［5-6］建立CA-AKI模型：首先于尾靜脈注射吲哚美辛（10 mg/kg），其次分別于吲哚美辛注射后15 min和30 min經尾靜脈注射N-ω硝基-L-精氨酸甲酯（10 mg/kg）和碘海醇（3g I/kg）；EMPA+CA-AKI組適應性喂養1周后連續7 d予以恩格列凈（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃，禁水16 h后，余處理同CA-AKI組造模方式。同時予以足夠的食物及飲水喂養，注射碘海醇后12 h進行安樂死，經內眥靜脈叢采取血液及摘取雙腎臟。

3.2 腎功能檢測驗證CA-AKI模型穩定性經內眥靜脈叢收集各組血液，靜置20 min，2 464×g離心20 min，收集上層血清。按照試劑盒說明進行血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）及肌酐清除率（creatinine clearance rate，CLCR）水平檢測，CAAKI定義為SCr高于基線值25%［7］。

3.3 腎臟組織HE染色4%多聚甲醛固定腎臟組織，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木精、伊紅染色，脫水封片，于顯微鏡下觀察各組腎臟組織病理改變情況，并進行圖像采集。病理學變化主要包括：腎小管上皮細胞腫脹、管間出血、刷狀緣丟失、細胞質空泡變性等。隨機選取10個髓質部視野，根據評分標準進行評分（0～4分）［8］：0分：無腎小管損傷；1分：受損腎小管小于20%；2分：受損腎小管為21%～50%；3分：受損腎小管＞50%；4分：所有上皮細胞完全破壞。

3.4 腎臟組織TUNEL染色固定各組腎臟組織經全自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片、脫蠟，于超純水中浸泡5 min；檸檬酸微波修復8 min，PBS洗3次，每次5 min；暗處配制TUNEL熒光孵育液于37℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；加DAPI染核15 min，PBS沖洗；甘油明膠封片，掃描并采集圖像，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再于400倍視野下采集圖像，并進行凋亡細胞分析，計算細胞凋亡率。

3.5 Western blot分析取各組腎臟組織50 mg，加入1 mL裂解緩沖液，充分碾磨，并于冰上裂解30 min，將其吸入至EP管中，于4℃、12 000×g條件下離心30 min，使用蛋白質定量試劑盒對蛋白質濃度進行定量。將各組蛋白分別加入電泳道中，通過10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質，然后將其轉移到PVDF膜上，5% BSA溶液封閉1 h，按照β-actin（1∶5 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、caspase-3（1∶1 000）、細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C；1∶1 000）分別稀釋Ⅰ抗孵育，4℃過夜。次日復溫30 min，TBST洗膜30 min，Ⅱ抗孵育1 h，再行TBST洗膜30 min，于發光液下顯影，Image J軟件進行統計分析。

3.6 免疫組織化學染色石蠟包埋后切片、脫蠟至水，將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（PH 6.0），微波爐高火加熱10 min進行抗原修復，放入3%雙氧水，室溫10 min阻斷內源性過氧化物酶，滴加山羊血清封閉液封閉20 min，滴加Ⅰ抗，4℃過夜后PBS洗滌，滴加Ⅱ抗，37℃孵育30 min后再次PBS洗滌，滴加DAB顯色液，室溫顯色，然后蒸餾水洗滌切片，終止顯色。經蘇木素復染3 min，中性樹膠封片，采集圖像，分析數據。

3.7 氧化應激指標檢測取適量血清標本，按照試劑盒說明書分別檢測MDA含量及SOD和GSH-Px活性。使用分光光度儀分別檢測波長為450 nm、532 nm、600 nm、560 nm、412 nm處的吸光度（A）值，并進行數據統計分析。

4 統計學處理

使用SPSS 26.0軟件進行統計分析，所有計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組之間的差異通過t檢驗進行評估，多組之間通過單因素方差分析進行比較。以P＜0.05為有差異統計學意義。

結 果

1 大鼠CA-AKI模型的建立

分別于不同時點（造影劑注射前及造影劑注射后6 h、12 h和24 h）檢測大鼠SCr、BUN、Cys-C和CLCR的水平。大鼠SCr、Cys-C和BUN水平在造影劑注射后逐漸升高，于造影劑注射12 h后達到高峰，后逐漸下降，CLCR在造影劑注射后逐漸下降，于造影劑注射后12 h后達到最低，后逐漸升高，見圖1。HE染色結果顯示，腎小管病理損傷程度于造影劑注射后逐漸加重，于造影劑注射12 h后病理損傷明顯，出現腎小囊腔擴張，腎小球萎縮壞死，腎小管彌漫性脂肪變性、擴張，局部間質血管、腎小球毛細血管充血、淤血等現象，見圖2。

Figure 1.Effect of contrast medium on renal function in rats.The levels of SCr（A），BUN（B），Cys-C（C）and CLCR（D）before and after injected with contrast medium at different time points（0，6，12 and 24 h）in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 造影劑對大鼠腎臟功能的影響

2 恩格列凈對大鼠CA-AKI的影響

與CA-AKI組比較，恩格列凈干預后，大鼠血清SCr，BUN和Cys-C水平下降（P＜0.05），CLCR水平上升（P＜0.01），見圖3。HE染色顯示：與CA-AKI組比較，恩格列凈干預后，腎小管病理損傷評分顯著降低（P＜0.01），見圖4。

3 恩格列凈對大鼠腎臟細胞凋亡的影響

通過TUNEL染色觀察腎臟細胞凋亡情況顯示，造影劑注射引起大鼠腎臟細胞凋亡顯著增加（P＜0.01）；與CA-AKI組比較，恩格列凈干預后，大鼠腎臟細胞凋亡率顯著下降（P＜0.01），見圖5。進一步通過Western blot和免疫組化染色檢測凋亡相關蛋白的表達，結果顯示，造影劑注射后導致大鼠腎臟促凋亡相關蛋白（caspase-3、Bax和Cyt-C）表達上調（P＜0.05）；而恩格列凈可顯著降低大鼠腎臟促凋亡相關蛋白（caspase-3、Bax和Cyt-C）的表達，并上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達（P＜0.01），見圖6、7。

Figure 2.Effect of contrast medium on renal pathological damage in rats（HE staining，scale bar=20μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs 0 h group.圖2 造影劑對大鼠腎臟的病理損傷

Figure 3.Effect of empagliflozin（EMPA）on renal function in rats.The levels of SCr（A），BUN（B），Cys-C（C）and CLCR（D）with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖3 恩格列凈對大鼠CA-AKI腎功能的影響

Figure 4.Effect of empagliflozin（EMPA）on contrast-induced renal pathological damage in rats（HE staining，scale bar=20μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖4 恩格列凈對大鼠腎小管病理損傷的影響

Figure 5.Effect of empagliflozin（EMPA）on contrast-induced renal cell apoptosis in rats（TUNEL staining，scale bar=20μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖5 TUNEL染色分析恩格列凈對大鼠腎臟細胞凋亡的影響

Figure 6.Effects of empagliflozin（EMPA）on apoptosis-related proteins（Bax，Cyt-C，caspase-3 and Bcl-2）in kidneys detected by Western blot.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖6 恩格列凈對腎臟組織凋亡相關蛋白表達的影響

4 恩格列凈對大鼠腎臟氧化應激的影響

通過相應試劑盒檢測SOD、GSH-Px活性和MDA含量評估大鼠腎臟的氧化應激情況，造影劑注射引起大鼠腎臟組織MDA水平顯著增加、SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.01）；與CA-AKI組比較，恩格列凈顯著增加大鼠腎臟SOD和GSH-Px活性，并降低MDA水平（P＜0.01），見圖8。

Figure 7.Immunohistochemical staining detection of renal apoptosis-related proteins（scale bar=40μm）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖7 腎臟組織凋亡相關蛋白的免疫組織化學染色情況

Figure 8.Effect of empagliflozin（EMPA）on renal oxidative stress in rats.The SOD activity（A），GSH-Px activity（B）and MDA content（C）with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖8 恩格列凈對大鼠腎臟氧化應激的影響

討 論

隨著心血管介入技術的普及和介入手術量的日益增多，CA-AKI成為臨床常見問題，發生于診斷和介入程序中血管內注射造影劑后，研究顯示，在PCI治療患者中CA-AKI發生率可達10%～25%，尤其以糖尿病合并冠心病患者為主［9］。既往研究提示CAAKI的發生可能與氧化應激、腎小管上皮細胞凋亡相關，但CA-AKI發生的具體機制尚未完全闡明。目前臨床實踐指南推薦水化作為預防CA-AKI的基礎，然而，預防性水化治療在保護腎功能方面的有效性還沒有得到充分研究證據，同時N-乙酰半胱氨酸、他汀類藥物等干預措施的有效性同樣存在一定爭議。因此，需尋找有效的預防和治療CA-AKI的藥物。

SGLT-2i可降低心衰患者住院率和心血管患者死亡率，目前廣泛應用于糖尿病和心血管疾病的治療［10-11］。課題組前期實驗提示，SGLT-2i可能通過抑制氧化應激和心肌炎癥反應，改善心肌重構，從而發揮心血管保護作用［12］。恩格列凈作為SGLT-2i類藥物，作用于SGLT-2受體的MAP17亞基，形成SGLT2-MAP17復合物，改變細胞膜電位差，保護腎小管上皮細胞，降低糖尿病患者的腎臟損傷［13］。然而，恩格列凈能否減輕造影劑對腎臟的損傷，目前尚無相關研究。

本實驗通過建立大鼠CA-AKI模型證實，恩格列凈可通過抑制氧化應激和細胞凋亡，降低CA-AKI的發生。氧化應激導致腎小管上皮細胞氧自由基生成增加和清除能力下降，使氧自由基蓄積于細胞內，引起細胞氧化障礙，導致腎小管上皮細胞損害或凋亡，進而發生CA-AKI。研究證實，Nrf2介導的氧化應激可加重造影劑對小鼠腎臟的損害[14]。本研究中，恩格列凈可使大鼠血清MDA含量下降，SOD和GSH-Px活性增加，提示恩格列凈可能通過抑制氧化應激進而減輕腎臟損傷。既往相關研究證實，CaMKⅡ/NFAT通路激活可促進腎小管上皮上皮細胞凋亡[15]。本實驗還觀察到，恩格列凈干預后，TUNEL染色提示腎臟細胞凋亡率較造影劑組顯著下降，同時腎臟促凋亡蛋白caspase-3、Bax和Cyt-C表達減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著增加，提示恩格列凈可能通過抑制細胞凋亡來防治CA-AKI的發生發展。

綜上，恩格列凈可能通過抑制細胞凋亡和氧化應激，減輕造影劑對大鼠腎臟的損傷，從而預防CAAKI的發生發展。然而，由于本研究對象為SD大鼠，與臨床患者有一定差異，需要臨床試驗進一步驗證恩格列凈對造影劑相關急性腎損傷的防治作用。此外，恩格列凈是如何調節腎臟細胞凋亡和氧化應激途徑的，我們將在進一步實驗中探討。