基于高通量測序技術分析瓶裝泉水中真菌生物多樣性研究

王菁華，劉 威，李月興，郭新明

(黑龍江省科學院自然與生態研究所，哈爾濱 150040)

真菌是異養類真核微生物的一種，主要包括單細胞酵母和多細胞絲狀真菌兩大類[1]，其中絲狀真菌常見于水源水體中，能夠在適宜的環境條件下繁殖，并借助流水進行傳播。如果真菌以水為媒介進入水處理和供水管道，極易附著在管道表面、接口處，形成生物膜或懸浮物長期生存并繁殖，導致水體污染，并通過生產環節污染瓶裝水，尤其是絲狀真菌肉眼能夠觀察到，形成沉淀，影響產品感官，甚至產生毒素對人體造成危害[2-6]。真菌具有廣泛性，很多企業的生產、貯存及廠房車間都存在真菌污染的潛在隱患[7]。真菌孢子繁殖可引發包裝物、墻壁等霉變，在瓶裝水中產生絮狀或絲狀沉淀，導致感官指標不合格，存在安全隱患，造成企業經濟損失[8-10]。

有關真菌在水中的生長繁殖研究主要集中在天然水體方面，瓶裝水的相關研究較少。徐向前[11]對地下水中絲狀真菌生長繁殖特性及二氧化氯滅火機制進行了研究，結果表明，水質指標中，pH值、碳氮比及溫度是影響其活性的主要因素，而無機離子鐵錳濃度對其影響較小。韓琳等[12]對瓶裝薄荷水生產過程中的霉菌污染進行檢測分析發現，霉菌類型并非全部是水生霉菌，導致這種問題發生的原因很可能與環境、包裝物污染有關。Hageskal 等[13-14]研究發現，在地表水中，真菌能夠大量繁殖且速度快，多樣性程度高，這主要與地表水的水質尤其是有機物含量密切相關，同時無機鈣離子也是影響真菌繁殖的重要因素之一。

高通量測序分析技術是目前應用較為廣泛的一種微生物分析手段，可有效對樣本進行真菌菌群的多樣性分析[15]。真菌在水體中的繁殖研究尤其是在瓶裝水中的污染并未引起足夠的重視，本研究對市售的不同產區的瓶裝泉水中的真菌菌落多樣性進行分析，為掌握真菌分布規律和產品質量控制技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓶裝水樣品：分別采集自黑龍江省5個地區的市售瓶裝水。1號樣品采集自哈爾濱，2號樣品采集自五大連池，3號樣品采集自克東，4號樣品采集自北安，5號樣品采集自大興安嶺。

試劑：E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(美國Omega生物科技有限公司生產)，Qubit3.0 DNA檢測試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司生產)，10105ES03 2×Hieff? Robust PCR Master Mix(翌升生物科技(上海)股份有限公司生產)。

1.2 儀器與設備

DYCZ-21電泳儀(北京市六一儀器廠生產)，FR-1000凝膠成像系統(上海復日科技有限公司生產)，Q32866 Qubit3.0熒光計(英杰生命技術有限公司生產)，A00582 Illuminate MiSeq PE300測序儀(生工生物工程(上海)股份有限公司生產)。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將采集的水樣5 000 mL進行抽濾，抽濾膜選擇孔徑0.45 μm。將水樣濃縮到抽濾膜上，按照水體基因組DNA提取試劑盒操作說明提取樣品DNA。每次抽濾所需水樣用量5 L，單個樣品需要重復提取3次DNA。將提取的DNA樣本進行充分混合，再取1份進一步檢測。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測序

上述制得的DNA樣本經檢測合格后作為模板擴增18SV4區，擴增引物為18SV4F(GGCAAGTCTGGTGCCAG)和18SV4R(ACGGTATCTRATCRTCTTCG)進行第一輪擴增。PCR反應體系(30 μL)：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F 1 μL，Primer R 1 μL，PCR products 10～20 ng，H2O 9～12 μL。使用移液器輕輕吹打或震蕩混勻并短暫離心，將反應液離心至管底。PCR反應體系條件：94℃ 3 min、94℃ 30 s、45℃ 20 s、65℃ 30 s、94℃ 20 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s、72℃ 5 min、10℃循環。之后引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增，體系條件(30 μL)：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL，Primer F 1 μL，Index-PCR Primer R 1 μL，PCR products 20～30 ng，H2O 9～12 μL。使用移液器輕輕吹打或震蕩混勻并短暫離心，將反應液離心至管底。將PCR管置于PCR儀中進行擴增，PCR反應條件：95℃ 3 min、94℃ 20 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s、72℃ 5 min、10℃循環。利用IlluminaMiSeqTM/HiseqTM測序平臺，對真菌18SV4區基因序列進行測序。利用USEARCH，將序列按97%相似度聚類為可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。利用基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)，在Silva數據庫(https：//www.arb-silva.de/)對真菌序列進行分類注釋，獲得有效的OTU分類學信息。

1.3.3 數據分析

數據分析主要基于R語言，對其進行分析獲得真菌門、綱、目、科、屬的組成情況，再利用vegan包對主坐標(pricipal coordinates analysis, PCoA)進行分析，從而獲得不同地區瓶裝泉水樣本中的真菌分布特征。

2 結果與分析

2.1 多樣性分析

2.1.1 Alpha多樣性分析

5份瓶裝泉水樣品的真菌18SV4區測序共獲得121 766條真菌序列，按照97%相似度歸類并進行Alpha多樣性分析，可以反映微生物群落的豐度和多樣性，結果見表1。

表1 5份瓶裝泉水樣品真菌菌群α-多樣性指數統計表Tab.1 Statistical table of α-diversity index of fungal flora in 5 bottled spring water samples

α多樣性指數主要對單個樣本數據進行分析，再以統計學指數反映微生物群落的多樣性和物種豐度。由表1數據可知，5份天然瓶裝水樣品累積獲得179個OTU，樣品3的OTU數最高，為57；樣品4的OTU數最低，為15。Chao指數常用來估計物種總數、指示菌群豐度，與物種豐度成正比，5個樣品的豐度最高為57.0，最低為15.0。Shannon指數從均勻度和豐富度兩方面來體現菌群多樣性，數值越大多樣性越高，測試樣品的Shannon指數1號最高，為3.34；3號最低，僅為1.04。Coverage指數常用作反映測序群落的覆蓋率，數值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低。5份樣品的Coverage均為1.0，說明測序結果能夠較好地反映樣品中真菌的情況，所有提供的樣本中真菌的物種信息基本全被覆蓋。通過以上數據分析表明，不同產地的瓶裝泉水中，真菌菌群多樣性存在較大差異，這可能是生產工藝流程對水質處理能力和條件差異導致的，物種多樣性越高，生產工藝對水質的作用越小，需加強對水質處理工藝的調整。

2.1.2 Beta多樣性分析

PCoA(principal co-ordinates analysis)是一種研究數據相似性或差異性的可視化方法，通過一系列的特征值和特征向量進行排序后，可以用于顯示個體和群體間的差異，樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。為進一步揭示真菌菌群相似度，基于nuifrac距離，對測序獲得的OTU進行主坐標分析，結果見圖1。

圖1 基于OTU數據5份樣品真菌菌群PCOA結果Fig.1 PCOA results of fungal community in 5 samples based on OTU

由圖1可知，PCoA1和PCoA2對樣品差異性方差貢獻率分別為52.08%和27.08%，累積方差貢獻率為79.16%，說明在5份樣品中，真菌組成存在差異，但不顯著。1號樣品和2號樣品距離較近，且更接近0，說明兩個樣品的群落進化分類更相似。3號樣品和5號樣品距離較近，說明兩個樣品的真菌菌群組成相似。4號樣品與其他4個樣品的距離比較遠，相似程度較低。通過數據比對，說明不同產地的瓶裝泉水真菌組成間在OTU水平上存在一定的差異性，但差異不顯著。

2.2 樣品真菌菌群結構分析

使用R軟件，分析樣本在不同分類水平上的群落結構，對比5個樣品的結構，進一步對瓶裝泉水中真菌菌落結構差異進行分析，基于門和屬水平的5個瓶裝泉水樣品真菌群落結構見圖2。

圖2 基于門(2-a)、屬(2-b)水平的真菌群落結構Fig.2 Fungal community structure at phylum(2-a) and genus(2-b) level

由圖2可以看出，5份瓶裝泉水樣品檢測到的179個OTU屬于17個門71個屬。在門分類水平上，豐度排名前5的分別為子囊菌門(Ascomycota)、擬桿菌門(Phragmoplastophyta)、未分類的真核(norank-Eukaryota)、毛霉門(Mucoromycota)和線蟲門(Nematoda)。其中子囊菌門的豐度最高，在5份樣品中的含量分別為17.11%、41.15%、50.87%、10.51%和12.64%。擬桿菌門在3號樣品中的含量較高，達到47.67%。毛霉門在1、2和3號樣品中有檢出。

在屬分類水平上，共檢測到71個真菌屬。由圖2-b可以看出，5份樣品水中真菌菌群在屬分類水平上出現了較大差異。其中3號樣品水中相對含量高于1%的真菌屬只有4種，分別是山茶屬Camellia47.70%、曲霉屬Aspergillus43.71%、枝孢屬Cladosporium7.06%和Schima1.13%。1號樣品中含量高于1%的真菌屬有26種，高于5%的真菌屬共有7種，含量最高的是Panagrolaimus7.11%，其余6種分別是Solanum6.58%、norank_Eukaryota6.32%、Rhabditis5.66%、Metus5.53%和Chlorella5.53%。2號樣品中含量高于1%的真菌屬有24種，含量高于5%的真菌屬有6種，分別為norank_Eimeriidae11.46%、Niesslia11.25%、Panagrolaimus8.80%、Geocenamus5.72%、Eleutherascus5.53%和Irantylenchus5.25%。4號樣品中含量高于1%的真菌屬有11種，含量高于5%的真菌屬有6種，分別為Solanum22.74%、Mortierella17.11%、Rhizopus13.85%、Aphelenchoides11.00%、Gyrodinium9.13%和Pichia8.31%。5號樣品中含量高于1%的真菌屬有24種，含量高于5%的真菌屬有4種，分別為Rhizopus21.09%、norank_Eukaryota12.98%、Heteromita8.24%和Vermamoeba5.05%。

數據表明，5份樣品中，在門分類水平上檢測到17個分類，共有的門類有5種：擬桿菌門、子囊菌門、Nematoda、Arthropoda、Chlorophyta。但是在屬分類水平上沒有一種真菌屬同時存在于每份樣品中，結合樣本α多樣性和β多樣性分析可以看出，不同樣本之間在屬分類水平上多樣性存在顯著差異。

2.3 瓶裝水中潛在致病菌的分布

對5份樣本水進行高通量測序，共檢測出3種潛在致病菌屬，均是子囊菌門。其中，曲霉屬真菌Aspergillus在3份樣本中檢測出，鐮刀霉屬Fusarium在1份樣本中分離檢測到，假絲酵母菌屬Candida在1份樣本中檢測出。曲霉屬真菌存在一些條件致病菌，如黑曲霉等常在飲用水中被檢測出，而通常情況下，曲霉的污染很大概率是通過水源污染傳播的。本次調查中的曲霉屬主要是黑曲霉種。假絲酵母菌被認為在長期飲用后，會引起人體免疫力下降，導致臟器、黏膜、皮膚等急性或慢性炎癥，而鐮刀霉屬也是引發飲用水污染的一種真菌。

3 結論

真菌廣泛存在于水環境中，而飲用水供水系統經常受到環境真菌的污染，存在一定的安全風險。本項目對市售的瓶裝水進行樣品采集，共采集樣品5份，通過高通量測序方法，對采集的樣本進行了真菌在18SV4區基因序列檢測分析，共計檢測到17個門、34個綱、54個目、65個科和71個種，并對其多樣性和潛在風險進行了分析和評估。

通過對群落組成進行分析發現，子囊菌門是包裝飲用水的優勢菌門，但是每個樣品間優勢菌屬各不相同，沒有一種菌屬同屬于5份樣本中。結合α多樣性和β多樣性分析，不同地區采集的樣本具有一定的差異，同時受到不同水處理工藝的影響，也可能導致瓶裝水檢測群落結構存在較大差異。在部分樣品中檢測到曲霉屬、鐮刀霉屬和假絲酵母菌屬的存在，表明其可能穿透水處理工藝的多級處理工藝屏障，最后在成品包裝水中被檢測到，這也反映出現有的凈水工藝技術和部分廠家的工藝流程無法將其有效去除，這些菌屬的存在可能導致一定的隱患，需要引起生產廠家和監管部門的注意。飲用水真菌的生物安全問題不容忽視，需要更多的研究發現其傳播途徑，找到合理有效的控制手段。