CLCA1 的功能及在疾病中的作用研究進展

萬勝君 柯昌斌

湖北醫藥學院附屬太和醫院麻醉科，湖北十堰 442000

1992 年，Ran 等[1]從牛氣管中分離出第一個鈣激活氯通道調節劑（calcium-activated chloride channel regulator,CLCA）蛋白，并預測這是一種對氯離子通道阻滯劑具有陰離子選擇性和敏感性的通道蛋白。1995 年，Cunningham 等[2]在牛氣管的上皮細胞中克隆出一個與Ran 等[1]發現類似的鈣激活氯通道蛋白，將其命名為bCLCA1，這就是第一個CLCA 基因的發現。隨后該基因家族成員的數量不斷增長，到目前為止已在包括人、牛、小鼠、大鼠、豬、狗和馬7 個物種中發現CLCA基因[3-4]。CLCA 家族的蛋白質最初被認為是允許氯離子通過細胞膜的通道，直到2005 年，Gibson 等[5]發現這些蛋白質通過激活鈣依賴的氯通道（calcium-activated chloride channel，CaCC）來觸發氯離子穿過細胞膜的運動。

人體基因組存在4 種CLCA 基因，分別是CLCA1、CLCA2、CLCA3 和CLCA4。CLCA1 是人體內該家族第一個被克隆和鑒定的基因。研究表明，CLCA1 蛋白參與了炎性氣道疾病[6]、腸道疾病[7]和惡性腫瘤[8]等的發生和進展。充分了解CLCA1 蛋白的結構、表達分布以及其在相關疾病的作用機制，可為疾病的治療提供有價值的參考。

1 CLCA1 的分子結構與分布

1.1 CLCA1 的分子結構

CLCA1 是定位于1 號染色體短臂（p22-p31）上具有14 個內含子和15 個外顯子的長31 902 bp 的基因，其前端有一個包含L1 轉座因子片段的典型啟動子區域，編碼相對分子質量約為125 kD 的前體蛋白[9]，這是一種約由900 個氨基酸組成的分泌自裂解蛋白。

1.2 CLCA1 的分布

CLCA1 蛋白在多種動物體內發現，在小鼠、大鼠、豬、貓、牛和馬中鑒定和克隆了同源基因。CLCA1主要存在于正常的大腸、小腸和闌尾中，尤其在隱窩細胞中表達相對豐富，在病變的肺、胰腺、卵巢和健康的黏膜組織，如子宮、睪丸和腎臟也有一些表達[10-13]。

2 CLCA1 的分子特性

CLCA1 蛋白具有高度保守的蛋白結構域，對其進行純化的蛋白質、肽和全面的功能分析，證明它是一種新型的鋅金屬蛋白酶，具有自我催化裂解功能。CLCA1 現唯一已知的底物是其自身，在胞內合成后經過自催化裂解使得兩個裂解產物片段都分泌至胞外。CLCA1 的N 端信號序列引導蛋白質進入分泌途徑，并進行自催化裂解，從而產生約90 kD 和38 kD的N 端和C 端片段[14]。其N 端產物包含3 個結構域，分別為鋅依賴的金屬蛋白酶催化結構域（CAT）、富含半胱氨酸結構域（Cys）、von Willebrand A 型結構域（vWA），C 端產物為Ⅲ型纖連蛋白結構域（FnⅢ）。N端產物CAT 內具有類似于基質金屬蛋白酶和去整合素金屬蛋白酶的保守HExxE 催化基序，vWA 內具有保守的金屬離子依賴黏附位點。

3 CLCA1 的基本功能

CLCA1 的主要功能為激活CaCC，利用速率理論分析建立的模型證明CLCA1 通過降低離子在孔隙中轉運的能壘從而提高CaCC 的電導，增加內源性鈣依賴性氯離子電流的幅度[15]。對于CaCC 的激活，CLCA1的自催化裂解發揮不可或缺的作用，因為這種激活過程需要自裂解暴露包含CAT/Cys 和vWA 結構域的N端片段[16]。

4 CLCA1 的生理和病理作用

氯離子通道在生物體內廣泛分布，相比于氯離子的運輸，他們能更好地傳導其他陰離子。氯離子通道在物質跨細胞上皮運輸、細胞的增殖與分化、凋亡，乃至參與細胞免疫應答和細胞興奮性調節等過程中都具有關鍵作用。因此，作為氯離子通道調節劑的CLCA1 在生物體內也具有十分重要的作用。

4.1 CLCA1 在呼吸系統中的作用

CLCA1 在呼吸道黏膜表面表達3 種CLCA 蛋白，但調節黏液蛋白基因表達和隨之產生的黏液是CLCA1 特有的功能。CLCA1 由杯狀細胞和其他產生黏蛋白的細胞選擇性表達，通過啟動絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，在體內表達黏液蛋白，從而刺激黏液產生，并分泌到氣道黏液層[17]。

在維持氣道環境穩態中，氣道黏液通過發揮黏膜免疫和黏膜清除能力構成氣道防御系統的一部分，梗阻性黏液產生的主要來源是黏液細胞化生（mucous cell metaplasia，MCM），即小氣道上皮細胞分化為產生黏液的杯狀細胞。MCM 是由炎癥免疫細胞在應對過敏原、病原體等攻擊時產生的白細胞介素-13（inter leukin-13，IL-13）、IL-4、IL-9等輔助性T細胞2（helper T cell 2，Th2）觸發的。在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、支氣管哮喘等疾病中黏液分泌過度是一個主要的臨床和病理特征，當機體遭受上述疾病時，氣道內的杯狀細胞群有擴大的趨勢，即發生MCM。氣道黏液的最關鍵成分之一是黏蛋白MUC5AC，這是一種凝膠形成的可溶性黏多糖組成的糖蛋白。

4.1.1 支氣管哮喘 IL-9 在哮喘的氣道重塑中發揮重要作用，其在哮喘患者氣道上皮細胞中表達上調。IL-9對支氣管上皮細胞有多種影響，包括肥大、轉化為杯狀細胞表型等。Th2 型超敏反應產生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13 等細胞因子，其中IL-4、IL-13 與IL-9有一定的重疊作用，進一步推動哮喘的演變進程。

哮喘患者氣道上皮CLCA1 mRNA 表達上調[18]。研究表明，CLCA1 上調的部分原因是IL-9，在IL-9 轉基因動物的肺組織中CLCA1 表達顯著增加，氣管內注入IL-9 和Th2 細胞因子后CLCA1 的表達也明顯增多[19]。如前所述，IL-9 在哮喘黏液分泌中起重要作用，用人原代肺上皮細胞培養系證實，IL-9 直接上調MUC5AC。而CLCA1 似乎與MUC5AC 的高分泌也有關。這兩個基因都是在腫瘤壞死因子α 的刺激下，被誘導產生于氣道黏膜組織中的[20]，將CLCA1 引入人肺黏液上皮樣癌細胞（NCI-H292）可以誘導黏液的產生和MUC5AC 的表達[21]。但在另一項研究中，用siRNA轉染介導敲除NCI-H292 細胞系中的CLCA1 基因表達未能降低MUC5AC mRNA 或蛋白質水平[22]，這兩種相互矛盾的觀點使得CLCA1 和MUC5AC 之間的聯系更具探索性。另外，IL-13 也可通過驅動氣道上皮細胞CLCA1 過表達激活涉及MAPK13 的信號級聯，有效促進哮喘黏液分泌。總之，在哮喘氣道重塑過程中CLCA1 通過IL-9、IL-13 等細胞因子啟動一系列機制來參與MUC5AC 的表達和隨之而來的黏液分泌。

4.1.2 囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）CF 在肺部通常表現為慢性梗阻性病變。它由囊性纖維化跨膜電導調節因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突變引起。CFTR 的突變會擾亂正常的氯離子轉運，導致黏液鹽分不足和水分不足。

CLCA1 和CFTR 的組織表達譜有重疊，表明這兩個基因可能同時參與CF 的發病過程[23]。在CFTR 缺陷小鼠中發現的致命性腸道疾病可以通過上調CLCA1的表達來糾正。當CF 患者發生伴隨強烈炎癥反應的持續性氣道表面感染時，支氣管黏膜中IL-9 及其受體IL-9R 和CLCA1 的表達增加[6]，以類似于哮喘的方式，驅動修復氣道上皮損傷的IL-9 杯狀細胞增生通路。

4.1.3 COPD COPD 以杯狀細胞增生和黏液過度分泌為特征。CLCA1 在COPD 患者氣道內表達顯著增加[24]。如前所述，CLCA1 通過啟動MAPK 信號通路來表達黏液蛋白，在COPD 患者中這一通路高度激活，成為阻塞性黏液產生的主要來源。

4.2 CLCA1 在消化系統中的作用

腸道黏液通過潤滑和限制上皮與寄生在腸道的細菌之間的接觸來保護黏液層下面的上皮。黏蛋白2（mucins 2，MUC2）提供腸道黏液的結構骨架，MUC2分泌后可形成類似網狀的片狀結構堆積在一起，形成一種能夠阻止細菌穿透的篩分黏液結構網。

在腸道分泌的黏液中，CLCA1 沿著腸軸具有類似于MUC2 的黏液結構表達模式，由于它的N 端裂解產物中含有一個具有金屬離子依賴性黏附位點的vWA 結構域，CLCA1 可作為腸黏液中的一種內源性金屬蛋白酶水解處理MUC2，成為腸黏液加工的關鍵調節因子之一。

4.2.1 潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）UC 是由黏液結構破壞、腸上皮屏障功能持續失調引起的一種結腸黏膜炎癥性疾病。UC 患者結腸上皮細胞培養發現CLCA1 表達顯著下調[25]，CLCA1 表達的降低可能影響腸道黏液加工，破壞黏液屏障功能而導致UC 的發生。

4.2.2 囊性纖維性腸黏液病 在囊性纖維化患者中可觀察到腸道黏液停滯梗阻。在CF 模型中，CLCA1 的轉基因修復降低了其在小腸中的表達，改善了黏液阻塞的表型。另外，在囊性纖維化患者中，CLCA1 變異也與胎糞性腸梗阻有關[26]。

4.3 CLCA1 在癌癥中的作用

人和動物體內的離子通道通過影響細胞體積、細胞內pH 值、信號分子的產生以及蛋白激酶和磷酸酶的活性而參與腫瘤發生發展進程。因此，在上皮細胞的離子傳導過程中具有重要意義的CLCA 家族在腫瘤發生和轉移中同樣發揮著獨特的作用。CLCA1 的轉錄還被證明與原癌基因c-myc 的轉錄持續相關[27]。

4.3.1 CLCA1 在結直腸癌中的作用 絕大多數結直腸癌患者是由控制β-連環蛋白降解的APC 基因失活突變造成的，這兩個基因都參與Wnt/β-連環蛋白信號通路。Wnt 信號異常激活導致β-連環蛋白在細胞質中積累和核轉位，這是癌細胞增殖轉移的重要機制。

體外實驗結果表明，CLCA1 表達上調可能抑制Wnt/β-連環蛋白信號通路和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程[28]，已知異常的Wnt 信號可以觸發EMT 過程，這在癌癥轉移中也起著至關重要的作用。在EMT 過程中，上皮細胞轉化為間充質細胞，失去細胞間的黏附性和細胞極性，獲得遷移和侵襲性，揭示了CLCA1 能夠調節Wnt/β-連環蛋白驅動的腸細胞自發分化的機制。CLCA1 可能參與控制結直腸上皮細胞的增殖與分化，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，從而在結直腸癌的發生和轉移中起到抑制作用。

利用人腸癌細胞系（Caco-2）發現CLCA1 是腸癌細胞和腸道組織從增殖到分化的調節因子，CLCA1通過增強黏附分子E-cadherin 和腸堿性磷酸酶的表達促進腸上皮分化[29]。細胞從增殖到分化的轉變可能是由包括E-cadherin 介導的細胞-細胞黏附在內的特定生化事件觸發的。在結直腸癌中，E-cadherin 在高侵襲性低分化癌中的表達常被下調，因此通過上調CLCA1 來增加E-cadherin 的表達可能促進細胞分化，降低癌組織的惡性程度。

基于以上理論可推測，提高CLCA1 的表達在結直腸癌的發生轉移和惡性程度的控制中起重要作用。CLCA1 在結直腸癌組織中的表達低于癌旁正常組織，血清和組織中CLCA1 水平與結直腸癌組織學分級、轉移和腫瘤分期呈負相關。

4.3.2 CLCA1 在卵巢癌中的作用 卵巢癌的腹腔轉移主要依靠多細胞聚集物（multicellular aggregates，MCAs），CLCA1 對細胞聚集有影響，其在MCAs 形成過程中顯著升高，使用siRNA 敲除CLCA1 降低了癌細胞形成MCAs 的能力。蛋白質組學分析顯示，CLCA1 在卵巢癌細胞系（OV-90）中表達增加[8]。

4.3.3 CLCA1 在胰腺癌中的作用 基于質譜的蛋白質組學發現，CLCA1 在胰腺癌中是一種潛在的腫瘤抑制因子，其表達水平與患者生存期呈負相關[30]。CLCA1在正常的胰腺中不表達，但它存在于超過一半的胰腺癌組織中[10]，并可分泌到胰腺囊腫液和血流中。因此，CLCA1 可作為胰腺癌的備選生物標志物。

4.4 CLCA1 與骨癌痛

骨癌痛是原發性骨腫瘤或晚期侵襲性腫瘤引起的一種嚴重的并發癥。眾所周知，脊髓背角是外周感覺信號整合和中樞痛覺超敏反應神經環路信號轉導的關鍵部位。在前期的高通量基因測序工作中，檢測到CLCA1 在小鼠骨癌痛模型中脊髓背角層面的表達下降約60%。據此，圍繞CLCA1 是否參與骨癌痛的發生發展而展開的一系列工作正在進行中。

5 總結與展望

CLCA1 通過發揮金屬蛋白酶及氯離子通道調節作用，參與調控上皮細胞內陰離子的傳導從而影響黏液分泌、電解質轉運、信號通路傳導、細胞增殖與分化等生理及病理過程，而成為相關疾病的重要潛在靶點和標志物。然而，CLCA1 基因的發現到目前為止不過二十余年，關于它的研究僅局限在上述幾類疾病中，在其他病理狀態例如骨癌痛中CLCA1 是否發揮作用，尚待更深入和完善的研究。目前，針對CLCA1 而衍生的相關疾病治療手段和臨床藥物正處于缺乏階段。因此，面對這一空缺，在未來針對相關疾病的藥物發掘和探索中，CLCA1 具備十分重要的研究價值。