海分枝桿菌的研究進展

顧安康，張 宇

(天津市中醫藥研究院附屬醫院 1. 病理科； 2. 皮膚科，天津 300120)

海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)是一種眾所周知的引起皮膚和軟組織感染的致病分枝桿菌，在非結核分枝桿菌(non-tuberculousMycobacterium，NTM)中，是人類非呼吸系統感染的首要病因[1]。早期對海分枝桿菌的研究主要是由于其與結核分枝桿菌的遺傳相關性[2]，以及金魚(鯽魚)中海分枝桿菌的試驗性感染模仿了肺結核的發病機制。目前很多研究[3-4]報道了臨床領域出現的皮膚感染病例，與水族箱或海產品有關活動擴大相關。但至今對海分枝桿菌的認識仍有不足，其感染后引起的臨床表現有較大差異，給臨床診斷和治療帶來巨大挑戰，現對海分枝桿菌的研究進展作一綜述。

1 生物學特征

海分枝桿菌在顯微鏡下與結核分枝桿菌難以區分[1]，海分枝桿菌是一種多形桿菌(1.0～4.0 μm×0.2～0.6 μm)，無芽孢形成，無動力桿菌，真分枝，抗酸染色菌體呈紅色，類脂含量高。其菌落通常光滑或介于光滑與粗糙之間，在固體培養基上培養不見光時為白色或米黃色，光照后變為黃色或橙色，根據《伯杰氏系統細菌學手冊》及Runyon分類法，屬Ⅰ類-緩慢生長型光產色菌[5]，光致變色是由于crtb基因介導的亮黃色β-胡蘿卜素的活躍產生，并且該變色特性可以被氯霉素所抑制[6]。

海分枝桿菌與其他分枝桿菌一樣，是一種嚴格的需氧菌，首選的碳源是甘油、丙酮酸和葡萄糖，但乙醇亦可[1]。最佳的培養溫度是30～33℃，在35～37℃的溫度下保持靜態，更高的溫度下則失去生存能力[5]。海分枝桿菌在所有用于分枝桿菌生長的培養基中，包括Middlebrook 7H10、L?wenstein-Jensen(固體培養基)等均可生長[7]，培養基上方2%～5%的二氧化碳氣相可促其生長[1]。在原代培養基中，需要幾周的時間才能獲得陽性培養物；在傳代培養中，生長速度為1～2周，由于海分枝桿菌快速適應實驗室條件的能力，可以縮短至4～5 d[1]。海分枝桿菌攜帶單個rRNA操縱子，其小亞基16S rRNA序列包含緩慢生長分枝桿菌的基因特征，因此屬于緩慢生長分枝桿菌屬[7]。基因組分析表明，生長緩慢的物種中編碼氨基酸轉運/代謝(例如livFGMH操縱子)和轉錄的基因以及ABC轉運蛋白操縱子的缺失，致使氨基酸轉運受到抑制，從而出現緩慢生長物種的生物學特征和致病性[8]。

2 基因組的一般特征

目前海分枝桿菌至少有15個菌株亞型被發現，其中菌株M型以魚和人類為主要宿主，已從人體感染的標本分離和培養出，其完整基因組于2008年發布[9]，基因組長度為6.5 Mb，大于結核分枝桿菌(4.4 Mb)、麻風分枝桿菌(3.3 Mb)和潰瘍分枝桿菌(5.8 Mb)的長度，平均G/C含量為62.5%，擁有5 424蛋白質編碼DNA序列和65個假基因，46個tRNA基因，1個rRNA操縱子和1個23 kb耐汞質粒。研究[10]表明，海分枝桿菌和結核分枝桿菌基因組的相似性超過85%，共有3 000個直系同源基因。根據16S rRNA、編碼RNA聚合酶β亞單位編碼基因(rpoB)和65 kDa熱休克蛋白(hsp65)的系統發育樹分析，海分枝桿菌與結核分枝桿菌是關系最密切的兩個菌種(連同潰瘍分枝桿菌)之一，是結核分枝桿菌屬的一個分支。而海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌基因組核苷酸序列的同源性高達98%以上，依據用于物種識別的管家基因和結構基因[如核糖體操縱子序列和rpoB、DNA螺旋酶(gyrA和gyrB)、16S rRNA/16S-23S rRNA ITS序列以及hsp65]無法將海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌區別開來，二者的區別為潰瘍分枝桿菌產生分枝桿菌內酯(A/B/C/D)和含有超過300拷貝的兩個插入序列IS2404和IS2406[1]。研究[11]結果顯示，海分枝桿菌似乎是潰瘍分枝桿菌的祖先，其獲得了分枝桿菌內酯生物合成的基因質粒和隨后產生分枝桿菌內酯的能力，是物種形成的關鍵驅動力，因此，海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌一起構成潰瘍分枝桿菌-海分枝桿菌復合體(M.ulcerans-M.marinum)。

3 菌株的致病性和毒力

海分枝桿菌與其他分枝桿菌一樣，是公認的兼性細胞內病原體，不產生內部和外部毒素，也不會產生侵入性酶[12]，其致病性由菌體成分引起，在不與溶酶體融合的非酸性(pH為6.1～6.5)吞噬體中增殖。ESX(ESAT-6 secretion system)位點是編碼專門的ATP依賴性分泌器官的大型基因簇，通過分泌某些效應因子參與毒力，海分枝桿菌至少具有5個ESX ATP依賴性蛋白分泌系統，稱為ESX-1、ESX-3、ESX-4、ESX-5和ESX-6[9]，研究最深入的是ESX-1，其分泌的效應因子包括早期分泌靶向抗原(early secreting antigen target 6，ESAT-6，6 kD)和培養濾過蛋白肽段庫(culture filtrate protein 10，CFP-10，10 kD)，這是結核分枝桿菌和海分枝桿菌的主要毒力決定簇，在這兩個物種間具有高度保守性[10，13]。其關鍵功能之一是誘導吞噬體膜的破裂，目前的模型表明分泌性底物ESAT-6是吞噬體滲透所必需的，隨后細菌DNA被動泄漏到宿主細胞質，被循環GMP-AMP合成酶(cGAS)和干擾素刺激因子檢測出，以誘導Ⅰ型干擾素的產生[14]。海分枝桿菌也表達ESX-5分泌系統，目前已經證實有100多種外膜通道蛋白PE/PPE家族的蛋白質通過ESX-5系統轉運[15]。Weerdenburg等[16]報道ESX-5缺陷的海分枝桿菌在斑馬魚胚胎中毒力顯著降低，表明ESX-5也是一個重要的毒力因子。分枝桿菌屬(結核分枝桿菌)的另一個重要分泌系統是輔助Sec易位途徑SecA2，已證明幾種蛋白質是通過這種途徑分泌[17]。試驗表明在海分枝桿菌感染的小鼠模型以及斑馬魚中，SecA2的抑制可導致毒力因子蛋白激酶Ga的減少，干擾吞噬體-溶酶體與細胞膜的融合，導致肉芽腫的形成能力受阻[18]。

分枝桿菌內酯是潰瘍分枝桿菌的主要毒力決定因素，是一族化學結構上相似、多聚乙酰(polyketide)衍生的12元環大環內酯(macrolide)，具有一致的生物學活性，但毒力強度有所變化[19]。目前除潰瘍分枝桿菌外，其他種類的產分枝桿菌內酯的分枝桿菌(mycolactoneMycobacterium，MPM)，包括Mycobacteriumliflandii和Mycobacteriumpseudoshottsii，只在兩棲動物和魚類中引起疾病[20-21]。產分枝桿菌內酯的海分枝桿菌僅在西亞周邊地區(以色列、地中海和紅海)被發現，并從受感染魚類中分離出一種分枝桿菌內酯F[22]，但目前尚未在人類中發現和報道。2017年，臺灣地區Li等[22]在捕獲的香港疣蠑螈檢測到產分枝桿菌內酯的海分支桿菌，這是東亞地區第一次報道產分枝桿菌內酯的海分枝桿菌感染哺乳動物的研究，該研究表明MPM可能通過未確定的途徑進行跨界傳播。因此，進一步監測和調查不同地區水生和/或野生動物的MPM，并對相關菌株進行實驗室培養和深入研究，有可能發現國內游泳池肉芽腫高發的新致病菌株。

4 流行病學及臨床病理表現

海分枝桿菌感染患者多聚集在海邊或水域，中國、美國及歐洲各國等沿海、沿湖國家發病率相對較高[4]。目前，國內缺乏大規模的流行病學調查，海分枝桿菌感染的發生率未知。法國1996—1998年的年發病率為0.04/10萬人，丹麥的研究[4]顯示，2004—2009年的年發病率為0.04～0.06/10萬人，2010—2016年發病率為0.05～0.13/10萬人，海分枝桿菌感染的發生率呈遞增趨勢。男女比例大約為6∶4，絕大多數病例可追溯其外傷史及接觸史，其中多為海產品接觸史及魚缸劃傷史，報道職業多集中在漁民、家庭主婦及廚師等[23]。本病無傳染性，病例多為散發報道，然而Feng等[24]在2011年報道了中國江蘇海安養魚場的一起海分枝桿菌群體感染事件。臨床對本病宣傳力度不夠，患者對海分枝桿菌認識不足，導致患者在接觸魚蝦時防護不到位，就醫不及時，更有甚者對原有皮損進行清創治療致使雜菌感染，致臨床診斷更加困難。國內外的病例報告[4，23，25]表明，能在3個月內就診并正確診斷及治療的不足60%，部分病例病程可長達數十年，對人民健康造成傷害，對醫療資源造成極大浪費。

本病臨床誤診率較高，海分枝桿菌引起損傷的潛伏期為2～4周，亦可長達9個月，平均診斷時間為3.5個月[25]。男女比例1.48∶1，年齡分布為13～91歲，平均發病年齡為42.78歲[23]。人體的感染部位主要位于肢端，一項55例的病例研究[4]顯示，88.7%的感染部位為手指/手，32.1%累及上肢，下肢和關節分別為5.7%、3.8%，皮損以紅斑、丘疹結節為主，有時表現為膿皰、潰瘍、肉芽腫或疣狀斑塊[1]。Aubry等[1]的病例研究中，60%的患者表現為手指或手的單發孤立性皮損，僅25%的病例表現為孢子絲菌的串珠樣改變，20%～40%可表現為深部感染的腱鞘炎、關節炎或骨髓炎等；根據感染嚴重程度分為4個臨床類型[26]：孤立或有限(1～3個)病灶(Ⅰ型)、多個(>3個)病灶伴有炎性結節或呈孢子絲菌病樣分布特點或有膿腫和肉芽腫(Ⅱ型)、伴或不伴皮膚受累的深部感染(Ⅲ型)和播散性感染(Ⅳ型)。此病的組織學特征類似于其他分枝桿菌感染，可呈急性或慢性炎癥，可見結核性肉芽腫、纖維素樣變性及干酪樣壞死，Aubry等[1]認為肉芽腫中央為纖維素樣壞死，但不是干酪樣壞死，偶爾可以觀察到朗漢斯巨細胞。其組織病理學變化與取材時機、部位及取材手法等都有相關性，活檢在非潰瘍的化膿性區域進行，抗酸染色和培養均可獲得較高陽性率。

5 診斷和治療

在臨床診斷中，海分枝桿菌感染部位的載菌量非常低，通過組織學或抗酸染色找到病原學感染證據較為困難，而常規的分枝桿菌培養需要數周[1]，因此，分子生物學作為一種更快捷、更靈敏的診斷工具正日益得到人們的認可。近年來，國內外應用的檢測技術有16S rRNA擴增和測序雜交技術、熱休克蛋白65基因檢測技術[27]、環介素等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，高分辨率熔解曲線分析技術(high-resolution melting analysis，HRMA)，熒光共振能量轉移技術(fluorescence resonance energy transfer，FRET)等[7]。同時，有學者用PCR限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析法作為一種既敏感又快速的方法鑒定了14個非結核分枝桿菌菌屬，其結果與常規細菌學鑒定結果一致[28]。自2014年二代測序首次被用于臨床感染病例的病原學診斷以來，其正越來越廣泛地被應用于臨床實踐。

結核T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT．TB)是一種干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay)，通過檢測外周血中經結核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后釋放干擾素的T淋巴細胞，判斷是否感染結核的技術。如上所述，海分枝桿菌與結核分枝桿菌共享這項檢測中使用的特定抗原；而基因組測序顯示，ESAT-6和CFP-10編碼基因的差異1區域，也存在于堪薩斯分枝桿菌[29]、蘇爾加分枝桿菌和戈登分枝桿菌[30]同源基因序列中。因此，干擾素γ釋放試驗在海分枝桿菌感染的診斷中有一定的參考價值，但不能作為診斷標準。

目前，對于海分枝桿菌感染的治療還缺乏關于藥物選擇、劑量和濃度的統一規范或標準[31]。在美國一項回顧性研究[32]中，海分枝桿菌感染患者在確診前，65%患者被診斷為其他感染性疾病并接受抗菌藥物治療，其中使用頭孢菌素和青霉素治療的人數最多；21%患者被誤診為真菌感染而使用口服伊曲康唑等，貽誤治療時機。在目前的研究報道[7]中，利福平、鏈霉素、紅霉素、乙胺丁醇、異煙肼、多西環素、卡那霉素、乙硫異煙胺、米諾環素和四環素均有取得治療成功的案例。根據體外藥敏試驗推薦的治療方案：采用利福平或利福布汀、乙胺丁醇和克拉霉素，二聯或三聯，療程2周～18個月[1]。單用抗菌藥物對海分枝桿菌早期皮膚感染有效，但深部組織感染及播散性感染需聯合應用抗菌藥物及手術治療[1]。根據海分枝桿菌不耐高溫的特性，有研究[33]中應用熱敷療法，效果良好。其他療法，如冷凍療法、X射線療法和電化療法[23]，已有報道但尚未得到評估。當發生海分枝桿菌感染的患者接受藥物治療時，應定期監測肝功能、腎功能及藥物相關不良反應，適時調整用藥及保護重要器官功能，還應建議在抗菌藥物治療期間停止腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抑制劑或其他免疫抑制治療[34]。

6 預防和展望

由于目前還沒有關于海分枝桿菌感染的人際傳播報告[1]，預防環境接種是根除這種疾病的主要戰略。鑒于海分枝桿菌感染絕大多數是散發病例[23]，個人預防應作為第一道防線，強烈建議從事海產品相關工作(包括日常生活處理海產品)或水族館維護人員戴手套，增強包括手部保護和衛生措施在內的常識性措施的傳播和推廣，并評估這些措施的有效性，從而進一步降低海分枝桿菌感染發病率。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。