聚合酶鏈式反應實驗技術在培養醫學研究生科研能力中的探索分析

龐麗君 裴明霞 劉 凱 林明華 陳德喜

首都醫科大學附屬北京佑安醫院北京市肝病研究所，北京 100069

聚合酶鏈式反應（ploymerase chain reaction，PCR）是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA 片段，可看作生物體外的特殊DNA 復制。PCR 技術是20 世紀80 年代中期發展起來的體外核酸擴增技術，具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點。PCR 技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑，不僅可用于基礎研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫學調查和農業生物技術研究等方面，可以從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA 供分析研究和檢測鑒定[1-2]。PCR 技術是分子生物學的基本技術之一，也是科研工作中很常用的技術，因此，熟練掌握PCR 技術對研究生以后的科研學習以及臨床工作都有至關重要的意義。

1 實驗原理

PCR 技術是以擬擴增的DNA 分子為模板，以一對與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA 聚合酶作用下，按照半保留復制的機制沿DNA 模板鏈延伸直至完成兩條新鏈合成，重復這一過程，即可使目的DNA 片段得到擴增。PCR 技術中反應步驟包括預變性、變性、退火、延伸、再延伸幾個部分。首先，模板DNA 發生變性，即高溫下模板DNA 雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結合，為后續反應做準備；其次，模板DNA 與引物的退火，是指模板DNA 經過加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板單鏈DNA 上特定部位配對結合的過程；最后，進行引物延伸，DNA 模板-引物結合物在DNA 聚合酶的作用下，以靶序列為模板，四種脫氧核苷酸按堿基互補配對原則連接在引物之后，使其延伸合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈[3-4]。

2 教學目標

基于課程內容要求、具體專業特點，并圍繞培養學生科研素養的要求，制訂了如下教學目標：①基于課堂實例講解，結合實驗原理及操作步驟，認識并理解PCR 技術在科研和臨床中的應用。②利用已知的基因DNA 序列，嘗試設計相應片段大小的擴增引物。③通過實驗課教學，掌握PCR 技術的操作步驟和儀器設置。④建立科學的病原微生物實驗室生物安全意識，并在實驗過程中嚴格遵守及執行。

3 教學過程

3.1 實驗理論

PCR 的主要成分有模板、引物、DNA 聚合酶、底物脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）[7]。以100 μl 總體系為例，各種組分按如下比例加入，10×緩沖液10 μl，4 種dNTP 混合物各200 μmol/L，模板0.1～2.0 μg，DNA 聚合酶2.5 U，Mg2+1.5 mmol/L，加ddH2O 將體積補至100 μl。PCR條件如下：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，共30 個循環；72℃再延伸5 min。

3.2 實驗設計及安排

考慮到本課程的學生大都是首都醫科大學附屬北京佑安醫院各科室的研究生，醫院又屬于傳染病相關醫院，無論是在科研學習還是以后工作中很可能會涉及感染及傳染性樣本，本實驗課中設計使用乙型肝炎患者樣本，學生通過自己提取乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA 樣本，更深刻地理解病原微生物生物安全操作。我們準備了不同病毒載量的HBV 患者血清樣本，在生物安全柜中完成HBV DNA 的整個提取過程。開始實驗前，臺內的廢液桶內先噴灑含氯消毒液，實驗過程中如果有樣本溢出到臺面上，及時用含氯消毒劑消毒，實驗完成后需要按生物安全要求丟棄實驗廢棄物。新型冠狀病毒肺炎疫情爆發后，各個機構都更加重視實驗室規范操作，意識到生物安全的重要性，因此在學生實驗技術培養過程中也加強了生物安全方面的培養。

本實驗課程計劃分兩次課完成，第一次進行DNA的提取，并檢測其濃度和質量；第二次進行PCR 擴增，擴增大約需要2 h，最后利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物并用凝膠成像儀拍照。

3.3 教學中發現的問題

在PCR 實驗課堂上，發現初學者在以下幾個方面的操作和流程上容易出現錯誤：不檢查引物濃度，未經稀釋直接加入儲存濃度的引物；用移液器進行混勻時，操作不夠輕柔，導致混合液中氣泡很多，不利于進行擴增反應，也會導致樣品損失；混勻后忘記瞬時離心；進行PCR 儀設定時，容易將分鐘設置成秒，這是一個很簡單但很容易出現的操作錯誤，設置好反應條件后一定要再次檢查確認；PCR 程序遺漏一項，沒有設定最后的低溫儲存，因為實驗安排有時不能及時去取擴增產物，避免產物降解，這步設定還是很有必要的。實驗課程的目的絕不僅僅是熟悉實驗步驟，更加著重培養學生的動手能力和嚴謹的科學態度，每個細節都可能會影響實驗結果，所以每步操作都不能隨心所欲。在實驗報告書寫及研究生平時進行科研實驗過程中，也發現一個很容易被學生忽視卻非常重要的問題，一部分學生不重視平時的實驗記錄，盲目著急做更多的實驗，并沒有及時做實驗記錄，甚至不做記錄，只保存實驗結果。其實很多時候實驗失敗是實驗細節導致，我們可以根據當時的實驗記錄得到更多提示，發現其中隱藏的問題，而科研人員經常遇到無法重現之前的實驗結果，有時也是因為沒有詳盡的實驗記錄，無法復原當時的實驗細節和條件。因此，實驗記錄的及時撰寫和整理對于科研學習至關重要。

4 回歸應用

由于時間有限，課堂上只能讓學生進行最基本最普通的PCR 實驗操作，實際上PCR 技術已與分子生物學技術結合形成了多種衍生技術，與醫學研究密切相關的有逆轉錄PCR 技術、原位PCR 技術、實時定量PCR 技術等[9-10]，其中實時定量PCR 技術是科研學習中應用最多的技術。

PCR 的用途非常廣泛，主要可以分為幾大類：獲得目的基因片段、DNA 和RNA 的微量分析、DNA 序列分析、基因突變分析、基因的體外突變。基礎科研方面的應用有目的基因克隆、構建重組質粒、構建點突變、缺失載體、基因表達檢測、甲基化分析、基因芯片等；臨床應用方面包括DNA 親子鑒定、法醫DNA 鑒定、HBV 耐藥監測、非侵入性產前染色體檢測、基因突變分析、細菌感染耐藥檢測等；其他方面的應用：農業方面包括轉基因成分的檢測、分子標記輔助育種中的單核苷酸多天性標記SNP 技術的應用，在食品監測及環境監測中也均有應用，例如對食品中某一細菌進行定量分析、檢測環境中的微生物含量等[11-15]。PCR技術看似相對簡單，功能卻很強大，眾所周知，PCR 核酸檢測對新型冠狀病毒肺炎的診斷發揮了極其重要的作用，其衍生應用不僅僅限于醫學，已涉及多個行業，是科研工作中不可或缺的一個技術手段。

5 教學總結

通過這幾年研究生實驗課的帶教工作，個人有以下體會。我們承擔的是研究生一年級《感染與傳染性疾病診斷新技術進展》的第一節實驗課，大部分研究生剛進實驗室或者仍未開始實驗室工作，對于實驗室的基本操作及常規儀器還沒有直觀的認識，需要從移液器的認識及使用、離心機的設置及使用等基礎知識開始教授。實驗課的目的不僅是讓學生學會某一個實驗，更是要讓他們從開始就建立規范操作的意識[16]。有些同學不重視實驗課，覺得直接跟著師兄師姐做實驗，學會操作就可以了，這是一個不太正確的想法，每個人都有自己的操作習慣，并不一定都是規范的，可能是他們沿襲前人做法，也可能是自己在實驗過程中摸索和總結的手法，但新手如果知其然而不知其所以然，只是盲目地模仿與重復，便領會不到其中的精髓。當以后自己獨立操作時，如果實驗過程中遇到從未見過的難題或者出現了無法解釋的實驗結果時，便會無從下手，其實很可能是哪個細節操作不規范，但卻意識不到，導致花費很多無謂的時間和精力去解決一些失誤。另外筆者認為還有一個很重要的原因，現在的各種試劑盒研發比較成熟，操作簡單快速，步驟一再簡化，按照說明書新手使用也比較得心應手，大大提高了實驗進度，但與此同時也給研究生的科研學習帶來一些問題，不了解每個步驟、每個試劑組分的功能，因此實驗遇到阻礙時，只是單純的重復，或者更換試劑盒，無法從中其中尋找問題的根源。

因此，在實驗課課堂上，從老師的角度講，不光是教會同學們怎么操作，首先要講清楚實驗原理，并且依次說明每個步驟的實際意義和所用試劑的功能，哪些步驟不可改動，哪些地方可以自主進行調整以及其中的原因，從而加強同學們對理論知識的理解，當然也要把自己親歷的、見到的錯誤做法舉例講解，以后的實驗中他們可以避免走入誤區或者遇到類似的問題不至于束手無策，能夠盡快找到失敗的根源[17-18]。同時，所有的實驗流程做到標準化、規范化，教師在課堂上要認真巡視和指導，及時糾正學生錯誤的實驗操作，適時示教規范操作，避免學生在以后的實驗中走不必要的彎路[19]。分子生物學實驗課是醫學研究生科研學習的一門基礎課程，其理論和技術是抽象和復雜的，為了提高學生對這門課程的學習興趣和動手操作能力，提高學生的分析、理解能力，可以采用啟發式和討論式的教學方法[17,20-21]。作為老師，我也會更加重視實驗課教學，通過更豐滿的教案和更生動的舉例使學生認識到實驗本身也許并無難點，但細節決定成敗。

通過實驗教學能夠加深學生對于理論知識的理解，提高其獨立動手的能力，對于加強學生創新能力的培養和科研綜合能力的提升至關重要[22-23]。但如果在課堂只是讓學生機械地模仿，也可能會使學生失去思考與創新的能力，因此教師可以讓學生更多地參與到實驗設計中，鼓勵研究生盡早參與到科學研究及創新活動中，訓練研究生的動手、分析與解決問題的能力，為將來科研及臨床學習打下堅實的基礎[24-25]