鉤吻氧化單萜吲哚生物堿及其抗真菌活性研究*

梁嘉俊，蒲 翔，赫 衛，潘 倩，周永強，周 英，魏 鑫

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

馬錢科(Loganiaceae)鉤吻屬(Gelsemium)植物鉤吻(Gelsemiumelegans)最早被記載于《神農本草經》中，又名胡蔓藤，斷腸草、大茶藥[1-2]，為著名毒性中藥，在我國南方鉤吻廣泛分布在福建，云南，貴州，廣東，廣西等地[3]。作為傳統中藥，鉤吻在民間以外用為主，具有祛風、殺蟲止癢、消腫拔毒的功效[4]，在一些少數民族地區，鉤吻常用于治療跌打損傷，骨折等骨關節疾病[5-6]。現代藥學研究發現鉤吻富含單萜吲哚生物堿類成分，具有抗炎鎮痛、鎮靜，抗焦慮，抗腫瘤，抑菌等活性[7-11]。前期鉤吻的中藥化學研究大部分集中于其根莖部位，并且發現一些具有良好抗菌活性生物堿類成分[12]，而針對鉤吻地上部分生物堿類成分研究報道相對較少。本文采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、高效液相色譜(HPLC)等多種分離技術對于鉤吻地上部位總生物堿進行了分離純化，結合核磁共振波譜(NMR)以及質譜(MS)等結構鑒定手段確定了所得單體成分結構，分離得到5個鉤吻定堿類氧化單萜吲哚生物堿，分別鑒定為19-xo-gelsenicine(1)，14-hydroxy-19-oxogelsenicine(2)，gelsedilam(3)，Nb-methylgelsedilam(4)和gelsemoxonine(5)(圖1)，并對鉤吻總生物堿提取物以及化合物1和3的抗真菌的活性進行了評價，研究發現在100 μg/mL的濃度下鉤吻總生物堿提取物對辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)菌絲生長抑制率為34.80 %。

圖1 化合物1-5的結構圖

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 核磁共振共振儀(AVANCE NEO 400 MHz)購買自德國Bruker公司，RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-III循環水式多用真空泵購買自鄭州長城科工貿易有限公司，DL-400循環冷卻器(鄭州長城科工貿易有限公司)，SB-600DTY超聲波多頻清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，FA2104N電子天平購買自上海菁海儀器有限公司，半制備高效液相色譜儀(LC-52)購置于Separation(Beijing)科技公司，GF254硅膠板、柱層析硅膠(200-300目和80-100目)均購買于青島海洋化工有限公司，MCI(GEL-CHP 20P)(Mitsubishi Chemical Co.，Ltd.Japan)，Rp-18半制備柱(250 mm×10 mm，5μm)購買于賽譜銳思(北京)科技有限公司；恒溫暗培箱購買自常州華普達教學儀器有限公司；DMSO購買自北京索萊寶科技有限公司；二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮均為分析純購買于天津市富宇精細化工有限公司。鉤吻藥材地上部位于2021年4月購自云南眾和植域生物科技有限公司，經昆明植分生物技術有限公司鑒定師婁安瑞鑒定為馬錢科鉤吻屬鉤吻Gelsemiumelegans(Gardn.et Champ.)Benth.，標本保存于貴州中醫藥大學中藥民族藥重點實驗室，標本號為WX_20210401。

1.2 提取與分離 干燥鉤吻地上部分 20 kg，用乙醇浸提三次，回流提取兩次，每次 2 小時，合并提取液并減壓回收乙醇得浸膏 3893 g，加適量水溶解，然后加入稀鹽酸酸化至PH=2，放置過夜，過濾，濾液用氨水調堿性至PH=10，二氯甲烷萃取，得浸膏221 g，萃取后浸膏硅膠(80-100目)拌樣，利用硅膠柱(200-300目)色譜梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷-甲醇體系(v/v 100% → 0%)梯度洗脫，通過薄層色譜分析得 25個組分，分別為 L-1至L-25。

L-5和L-6合并后利用硅膠柱(200-300目)色譜梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷-乙酸乙酯(v/v 2∶1 → 1∶4)，后經MCI柱色譜(甲醇-水v/v 40% → 100%)梯度洗脫后得分段GL-1至10，GL-7進行MCI、ODS，硅膠柱色譜洗脫，最后利用制備型 HPLC(乙腈-水v/v 20% → 60%)40 min梯度洗脫，得化合物1(6 mg)和化合物3(5 mg)，MCI 柱色譜洗脫后及GL-5剩余樣品合并得分段GL-6，進行 MCI，硅膠柱色譜，ODS柱色譜洗脫，梯度洗脫，最后分別利用制備型 HPLC(乙腈-水=30% → 100%)40 min梯度洗脫，得化合物2(5mg)；(乙腈-水=30% → 100%)30min梯度洗脫得化合物4(10 mg)；(乙腈-水=40% → 80%)30 min 梯度洗脫得化合物5(38 mg).

1.3 抗真菌活性評價和菌絲生長抑制率測定 將在室溫保存的辣椒疫霉菌菌種接種在燕麥固體培養基(OMA培養基)上進行培養，在25 ℃-28 ℃ 下恒溫暗培養3天至對照白色菌絲充分生長繁殖布滿整個培養基表面。取提取物0.5 mg(20 μL DMSO稀釋)，燕麥培養基 5 mL，加入到6 cm培養皿中混勻，對照加入20 μL DMSO。用Φ 0.8 cm打孔器在新鮮菌平板打菌餅，取1個菌餅倒置培養基平板中央，培養3天，每天采用“十”字交叉法測量菌落大小，計算菌絲生長抑制率。

菌落直徑(cm)=測量直徑-0.8 cm

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/ 對照菌落直徑×100 %

2 結果

2.1 結構鑒定

2.1.1 化合物1C19H20N2O4，1H NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ 2.58(3H，s，H-18)，3.42(1H，t，J=9.2 Hz，H-16)，3.70(1H，dd，J=4.3，2.5 Hz，H-3)，3.90(3H，s，Na-OMe)，4.32(2H，m，H-17)，6.96(1H，d，J=7.7 Hz，H-12)，7.11(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.31(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.57(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-9).13C NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ 26.2(C-18)，28.6(C-14)，38.9(C-6)，40.5(C-15)，40.5(C-16)，57.8(C-7)，62.4(C-17)，63.9(Na-OMe)，75.6(C-5)，76.4(C-3)，107.9(C-12)，124.7(C-10)，125.8(C-9)，129.5(C-11)，133.2(C-8)，139.1(C-13)，173.0(C-2)，179.7(C-20)，198.4(C-19).數據和參考文獻[13]相符。

2.1.2 化合物2C19H20N2O5，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 2.57(3H，s，H-18)，3.91(3H，s，Na-OMe)，4.72(1H，m，J=7.6，4.9，2.4 Hz，H-5)，6.96(1H，d，J=7.6 Hz，H-12)，7.13(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.32(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.59(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-9).13C NMR(100 MHz，Methanol-d4)δ 26.1(C-18)，38.6(C-6)，39.4(C-16)，49.9(C-15)，55.9(C-7)，61.9(C-17)，64.0(Na-OMe)，67.2(C-14)，75.2(C-5)，80.4(C-3)，108.0(C-12)，124.9(C-10)，125.8(C-9)，129.6(C-11)，133.0(C-8)，139.0(C-13)，172.8(C-2)，176.5(C-20)，198.3(C-19).數據和參考文獻[14]相符。

2.1.3 化合物3C17H18N2O4，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 3.74(1H，dd，J=4.9，2.0 Hz，H-3)，3.95(3H，s，Na-OMe)，4.12(1H，m，H-5)，4.24(1H，m，H-17)，6.98(1H，dd，J=7.7，1.1 Hz，H-12)，7.11(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.32(1H，td，J=7.8，1.2 Hz，H-11)，7.54(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-9).13C NMR(101 MHz，Methanol-d4)δ 27.8(C-14)，37.5(C-16)，37.7(C-6)，38.1(C-15)，57.2(C-7)，58.5(C-5)，62.6(C-17)，64.0(Na-OMe)，76.0(C-3)，108.0(C-12)，124.6(C-10)，125.8(C-9)，129.5(C-11)，133.1(C-8)，139.4(C-13)，173.2(C-2)，182.7(C-20).數據和參考文獻[15]相符。

2.1.4 化合物4C18H20N2O4，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 2.84(3H，s，Nb-Me)，3.70(1H，dd，J=5.0，2.0 Hz，H-3)，3.95(3H，s，Na-OMe)，4.04(1H，m，H-5)，6.99(1H，m，H-12)，7.12(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.32(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.54(1H，dd，J=7.5 ，1.1 Hz，H-9).13C NMR(100 MHz，Methanol-d4)δ 27.9(C-14)，28.4(Nb-Me)，33.3(C-6)，36.5(C-16)，38.1(C-15)，57.3(C-7)，62.5(C-17)，64.0(C-5)，64.6(Na-OMe)，76.3(C-3)，108.1(C-12)，124.6(C-10)，125.8(C-9)，129.5(C-11)，132.9(C-8)，139.4(C-13)，173.0(C-2)，179.3(C-20).數據和參考文獻[16]相符。

2.1.5 化合物5C19H22N2O5，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 1.09(3H，t，J=7.2 Hz，H-18)，2.23(1H，dd，J=16.0，4.8 Hz，H-6)，3.84(1H，m，H-5)，4.04(3H，s，Na-OMe)，7.09(1H，m，H-12)，7.18(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.38(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.58(1H，dd，J=7.5，1.2 Hz，H-9).13CNMR(100MHz，Methanol-d4)δ7.4(C-18)，30.0(C-19)，35.0C-16)，35.3(C-6)，55.8(C-7)，56.7(C-5)，62.2(C-17)，64.2(Na-OMe)，67.9(C-15)，69.3(C-14)，80.0(C-3)，108.5(C-12)，125.1(C-10)，126.6(C-9)，129.8(C-11)，132.1(C-8)，139.3(C-13)，175.4(C-2)，211.6(C-20).數據和參考文獻[17]相符。

2.2 抗真菌活性評價 通過觀察真菌菌絲的生長情況，對鉤吻總生物堿以及化合物1和3的抗真菌活性進行了評價，與對照組相比，能夠明顯發現鉤吻總生物堿在100 μg/mL的濃度下辣椒疫霉菌(P.capsici)具有中等的抑制活性，其菌絲生長抑制率為34.80 %，相同濃度下，化合物1和3并沒有顯示抗真菌活性，結果表明鉤吻總堿部位具有一定的抗真菌活性，提示鉤吻可能在辣椒疫霉菌的防治中具有一定的應用前景。

3 小結

鉤吻是中國著名毒性中藥，具有鎮痛、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[18]，同時鉤吻在畜牧養殖業也具有極高的應用價值，被稱為“豬人參”，可以對豬、羊等家畜產生促生長作用，極大提高了畜牧業的經濟效益[19]。辣椒疫霉菌是一種植物真菌，可引起辣椒疫病，是在世界范圍內普遍發生的毀滅性土傳病害[20]，其在土壤中可長期存在，同時可在受侵染的病殘體中存活，寄主范圍廣[21]。前期鉤吻的中藥化學研究大部分集中于其根莖部位，針對鉤吻地上部分生物堿類成分研究報道相對較少。采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、高效液相色譜(HPLC)等多種分離技術對鉤吻地上部位總生物堿進行了分離純化，結合核磁共振波譜(NMR)以及質譜(MS)等結構鑒定手段確定了所得單體成分結構，并且檢測了化合物1和化合物3及總生物堿提取物的抗辣椒疫霉菌活性，共分離得到5個鉤吻定堿類氧化單萜吲哚生物堿，分別鑒定為19-xo-gelsenicine(1)，14-hydroxy-19-oxogelsenicine(2)，gelsedilam(3)，Nb-methylgelsedilam(4)和gelsemoxonine(5)，抗菌活性測試發現鉤吻總生物堿提取物(100 μg/mL)對辣椒疫霉菌菌絲生長抑制率為34.80%，該研究為豐富鉤吻氧化單體吲哚生物堿的結構類群提供支撐和有益借鑒，為進一步的鉤吻生物堿藥理學篩選提供物質基礎，同時為辣椒疫霉菌的防治提供參考。