油菜根腫病菌的生物學特征

石茗，李永沖，劉經亮，倪明龍

(廣東食品藥品職業學院 廣東，廣州 510000)

油菜和大豆、花生、芝麻并稱為四大油料作物，與其他各國相比，我國油菜的種植面積及其總產量居首位。油菜根腫病俗稱“大根病”，又稱“油菜根癌病”，其病原菌蕓薹根腫菌屬于專性的寄生菌，目前廣布全世界，在歐洲南部及地中海西岸最早出現，尤以溫帶地區發生嚴重[1]。我國油菜于1995年初患此病[2]，現已遍布絕大部分地區，隨著外界環境惡化，此病的發病面積及危害程度正越來越大[3,4]。研究油菜根腫病菌的形態特征，為防治油菜根腫病提供依據。

1 材料與方法

1.1 油菜根腫病菌的形態特征

1.1.1 菌源于2019年3月在廣東省廣州市花都區油菜地采集油菜根腫病的新鮮病樣本，于-20℃冰箱內保存。

1.1.2 制備休眠孢子懸浮液參考馬淑青等[5]的方法，取油菜根腫組織，攪成勻漿，再經過過濾、沉淀等步驟制成休眠孢子懸浮液，于4℃冰箱內保存。

1.1.3 休眠孢子至管腔形態觀察首先，將休眠孢子懸浮液滴在銅網（200目）上進行沉淀，再將多余水分吸去，接著染色（2%磷鎢酸處理），將多余染液吸干后并晾干，用透射電子顯微鏡下觀察休眠孢子形態及休眠孢子至管腔的形態演變過程并測量大小。

1.2 溫度、pH值及光照與休眠孢子萌發的關系

1.2.1 溫度與休眠孢子萌發的關系在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，pH值設置為6.3上下，在0℃～40℃間，每隔4℃設置一個溫度，共設置11個溫度條件，分別在無光照條件下進行培養，孢子萌發情況的觀察統計于5d后進行電子顯微鏡下進行。

1.2.2 pH值與休眠孢子萌發的關系在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，在用酸度計測定pH值為2.5、3.5、4.5、5.0、6.4、7.4、8.4和9.4等8個條件下，在24℃及無光照條件下，分別進行培養，在5d后，進行電子顯微鏡下的孢子萌發情況的觀察統計。

1.2.3 光照與休眠孢子萌發的關系在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，pH值設置為6.3上下，24℃條件下，將三角瓶置于光照度為900Lx的日光燈下照射24h及無光照培養24h，5d后進行電子顯微鏡下的孢子萌發情況的觀察統計。

1.3 致死溫度測定

在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，pH值設置為6.3上下，將三角瓶分別置于36℃、39℃、42℃、45℃、48℃、51℃、54℃和57℃等8個溫度設置中，恒溫水浴鍋中處理10 min，分別在24℃條件下進行黑暗培養，休眠孢子的萌發情況5d后在電子顯微鏡下進行觀察統計，在以上溫度中，孢子無法萌出的最低溫度，可定為致死溫度。

2 結果與分析

2.1 油菜根腫病菌的形態特征

經負染色處理后，在透射電鏡放大800倍下，可觀察到游動孢子近腎形或近球形，大小為2.1～5.1pm，平均為3.6pm，其上著生2根長短不等的尾鞭。電鏡下觀察到休眠孢子至管腔形態演化進程為：在休眠孢子的孢子壁處，一個游動孢子被釋放出，約20～40min后，隨著游動孢子運動變得緩慢，其鞭毛逐漸脫落，而形成休止孢，同時可觀察到休止孢呈圓形，大小為1.5～2.1pm，囊化的游動孢子發育出一個長管狀空腔（管腔），此長管狀空腔有2.8～3.3pm（平均3.11pm）長，寬為1.2～1.3 pm（平均1.24pm）。

2.2 溫度、pH值和光照與休眠孢子萌發的關系

2.2.1 溫度與休眠孢子萌發的關系經試驗觀察，休眠孢子在4℃以上、40℃以下均可以萌發，試驗結果表明，24℃是休眠孢子最適宜萌發的溫度，最適宜溫度下，可測得孢子萌發率為67.8%，非24℃時，休眠孢子的萌發率均低于最適溫度（圖1）。此實驗數據表明休眠孢子萌發和溫度有重要關聯，田間發病狀況也證明了溫度的影響。

2.2.2 pH值與休眠孢子萌發的關系在pH6.4～7.4條件下，休眠孢子均可以萌發，試驗表明，萌發的最適為pH6.4，此pH值下，萌發率為67.5%，其他pH值下，休眠孢子的萌發率均低于最適為pH（圖2）。

2.2.3 光照與休眠孢子萌發的關系經過5d光照培養的休眠孢子，測得其萌發率為11.24%，對比經過5d無光照處理的休眠孢子，其萌發率為70.13%，由此得出，光照對休眠孢子萌發有明顯的抑制作用。

2.3 致死溫度的測定

試驗中測得休眠孢子在48℃處時的萌發率為2.46%，在51℃、54℃處理的樣品液中油鏡下未觀察到有孢子萌發，據此可以推測51℃為油菜根腫菌休眠孢子的致死溫度。

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 油菜根腫病菌的發生1995年我國初次發現油菜根腫病[2]，根腫菌存在不同的生理小種。根腫病菌的生理小種分化在1931年被Honig首次證明,Williams系統和ECD系統是國際上廣受認可的2個根腫病菌生理小種鑒別系統。

油菜根腫病菌休眠孢子的大小明顯大于甘藍根腫病菌休眠孢子[6]，導致這種狀況發生的原因后續課題將針對此疑問進行探究。

3.1.2 外部條件對油菜根腫病發生的影響研究表明，在土壤溫度10℃～30℃，尤其是當土溫為19℃～25℃，根腫病適宜發生。因此，可適當推遲播種進而使土壤溫度降低從而有效控制根腫病發生。休眠孢子致死溫度為51℃。所以可以在播種前想辦法使使土壤升高（例如覆蓋地膜），達到致死溫度殺死休眠孢子，有效預防根腫病的發生。

在pH值為6.0～6.7時，休眠孢子萌發的幾率大。為了提高農作物產量而盲目施用大量化學復合肥料、大氣污染及酸雨等使得土壤酸化，因此在控制根腫病時，一方面，可通過增施堿性肥料中和酸性。另一方面，增施有機肥，達到培肥地力的效果。

在有光照的情況下，休眠孢子的萌發受到明顯抑制。可通過光敏色素來抑制休眠孢子萌發的進程，進而控制根腫病的發生。

3.2 結論

3.2.1 油菜根腫病菌的形態特征

油菜根腫病菌體眠孢子至管腔的演化進程為：在休眠孢子的孢子壁處，一個游動孢子被釋放出，約20～40min后，隨著游動孢子運動變得緩慢，其鞭毛逐漸脫落，而形成休止孢，休止孢最后萌發而形成管狀結構。

3.2.2 油菜根腫病菌體眠孢子的生物學特性油菜根腫病易發生的條件是：溫度為24℃，pH值為6.4，無光照。其病菌的致死溫度是51℃。