miR-181a-5p及MEST在高級別漿液性卵巢癌組織中的表達及意義

陳晨 田甜 于嘯 孫文瑜 婁艷輝

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266100 1 婦科； 2 護理院感部)

高級別漿液性卵巢癌(high-grade serous ova-rian cancer, HGSOC)是上皮性卵巢癌最常見的病理類型，腫瘤具有較高的惡性生物學行為，極易發生廣泛的盆腹腔內轉移，嚴重威脅卵巢癌患者的生命安全。因此，探討HGSOC侵襲轉移的可能分子機制具有重要意義[1]。微小核糖核酸(miRNA)作為調節性短非編碼核糖核酸，通過調節多種信號通路進而參與腫瘤的發生與發展[2]。miR-181a-5p是miR-181家族的重要成員之一，研究表明miR-181a在肝癌及乳腺癌等多種實體腫瘤及血液腫瘤中異常表達，參與調控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲轉移等多種生物學特性，并且在Wnt/β-連環蛋白和TGF-β信號通路當中起著關鍵的調節作用[2-3]。然而，有關miR-181a-5p在HGSOC中的表達特點及功能尚不十分明確。中胚層特異性轉錄基因(MEST)是一種父源性印記基因，位于染色體7q32，在胎兒組織中表現出來自父系等位基因的優先表達，MEST啟動子的異常甲基化與腫瘤的侵襲轉移密切相關[4-5]。生物學信息分析發現miR-181a-5p與MEST之間存在靶向結合位點，因此推測二者之間可能存在一定的功能調控關系。本研究通過檢測miR-181a-5p與MEST在卵巢癌組織中的表達，旨在初步探討二者的表達特征及其與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1一般資料 選取2019年7月—2021年11月我院因HGSOC行手術治療的卵巢癌患者56例。所有患者術前均未經過放療及化學治療，患者的最終診斷均經病理檢查證實。術前簽署患者知情同意書，留取患者術中新鮮的卵巢癌組織作為研究樣本。收集同期因子宮肌瘤行子宮+雙附件手術切除的56例患者的正常的卵巢及輸卵管傘端組織作為對照。分別取卵巢癌患者的卵巢癌組織及對照組正常卵巢組織、正常輸卵管傘端組織各約1 cm×1 cm×1 cm大小，在離體30 min內置于裝有RNA保存液的凍存管中轉入-80 ℃冰箱內保存備用。

1.1.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測卵巢癌組織、正常卵巢組織及正常輸卵管傘端組織中miR-181a-5p和MEST的表達 各取卵巢癌組織、正常卵巢組織及正常輸卵管傘端組織100 mg于勻漿器中，利用研磨器研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol試劑處理，轉移勻漿至無RNAase的EP管中，在4 ℃下離心20 min后取上清液，之后步驟均嚴格按照Trizol試劑說明書進行操作。使用紫外分光光度計測定260、280 nm波長處的RNA樣本濃度以及吸光度(A)值，當1.8

表1 引物名稱及其序列

1.1.3一般資料的收集 收集卵巢癌患者的一般資料，包括年齡、體質量、術前血清中CA125水平、腫瘤臨床分期及是否有淋巴結轉移等。

1.2 基礎研究

1.2.1細胞培養 將卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞SKOV3(購自美國典型微生物菌種保藏中心)接種于含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱培養，每隔1～2 d換液一次，當細胞的密度達到約80%且生長良好時，用胰蛋白酶消化后每瓶細胞以1∶3的比例進行細胞傳代，或直接加入細胞凍存液置于-80 ℃冰箱凍存，用于后續雙熒光素酶實驗。

1.2.2雙熒光素酶報告基因驗證miR-181a-5p與MEST的靶向關系 ①采用TargetScan(www.targetscan.org)和miRanda(www.microrna.org)生物信息學軟件預測miR-181a-5p與MEST是否存在靶向結合位點。②利用雙熒光素酶試劑盒(購自大連美倫生物科技有限公司)進行驗證：采用PCR技術將含miR-181a-5p結合位點的MEST核苷酸序列片段插入野生型(WT)熒光素酶報告基因載體中，構建MEST-WT質粒；同時，應用基因突變技術將結合位點突變后，插入突變型(MUT)熒光素酶報告基因載體中，構建MEST-MUT質粒。將miR-181a-5p分子模擬物(mimics)以及其陰性對照序列(NC mimics)分別與MEST-WT、MEST-MUT質粒同時轉染SKOV3細胞，分為4組：MEST-WT+NC mimics、MEST-WT+miR-181a-5p mimics、MEST-MUT+NC mimics及MEST-MUT+miR-181a-5p mimics組；在轉染前24 h，首先取對數生長期的SKOV3細胞在24孔板鋪板(確保轉染時的細胞密度在50%～70%)；按照脂質體2000(美國Invitrogen 公司)說明書要求向1.5 mL EP管中先后加入10 μL無血清培養基、適量待轉染的試劑以及脂質體2000轉染試劑，靜置10 min，形成轉染復合物；將轉染復合物加入24孔板中，充分混勻，培養6～8 h后換成有血清的培養基，置于培養箱中繼續培養24 h后，參照雙熒光素酶報告基因實驗檢測試劑盒的說明書檢測熒光素酶活性，熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。實驗重復3次,實驗結果取均值。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 3種組織miR-181a-5p及MEST表達量比較

測定miR-181a-5p在卵巢癌、輸卵管傘端及正常卵巢組織中的相對表達量分別為0.383±0.165、0.987±0.036和0.996±0.050，MEST在卵巢癌、輸卵管傘端以及正常卵巢組織中的相對表達量分別為4.016±0.182、0.993±0.045和1.004±0.048，3種組織中miR-181a-5p和MEST相對表達量比較差異均有顯著性(F=123.236、234.764，P<0.05)。Pearson相關性分析結果則顯示，miR-181a-5p與MEST的相對表達量呈顯著負相關(r=-0.985，P<0.01)。

2.2 卵巢癌組織中miR-181a-5p及MEST表達與臨床病理特征間的關系

卵巢癌組織中miR-181a-5p及MEST的表達與患者年齡及體質量無關(P>0.05)；miR-18a-5p及MEST的表達與腫瘤FIGO分期有關，其中Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者miR-181a-5p的表達高于Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者MEST的表達低于Ⅲ～Ⅳ期(χ2=15.002、33.547,P<0.05)；miR-181a-5p及MEST表達與患者有無淋巴結轉移有關(χ2=7.844、11.187,P<0.05)；miR-181a-5p以及MEST表達與患者血清中CA125的表達水平有關(χ2=19.575、4.548，P<0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組織中miR-181a-5p、MEST的表達及與臨床病理特征的關系(例)

2.3 雙熒光素酶實驗驗證miR-181a-5p與MEST靶向結合位點

通過生物信息學分析預測到miR-181a-5p與MEST存在靶向結合位點，見圖1。miR-181a-5pmimics+MEST-WT組SKOV3細胞的熒光素酶的活性為0.41±0.23，NC mimics+MEST-WT組為0.98±0.04，兩組比較差異有顯著性(t=8.726,P<0.05)；miR-181a-5p mimics+MEST-MUT組SKOV3細胞的熒光素酶活性為0.97±0.01，NC mi-mics+MEST-MUT組為0.98±0.04，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。miR-181a-5p 能抑制MEST-WT的熒光素酶活性，而對MEST-MUT無影響，驗證了miR-181a-5p與MEST存在靶向結合位點。

圖1 miR-181a-5p與MEST的核苷酸序列結合位點

3 討 論

HGSOC是上皮性卵巢癌中最常見的一種病理類型，因其惡性程度高、侵襲性強，早期無明顯臨床癥狀及體征，70%～80%的患者診斷時已為晚期，居女性生殖系統疾病患者病死率的首位。廣泛盆腹腔轉移是HGSOC臨床進展的主要特征，也是最終導致病人死亡的主要原因，然而有關其侵襲轉移的分子機制仍不十分明確。由于其具有極易發生轉移、耐藥和復發的特性，在治療上依然面臨著極大的難題[6-7]。因此，探討卵巢癌復發和轉移的可能分子機制，尋找其治療靶點顯得尤為重要。

miRNA作為調節性短非編碼核糖核酸，通過調節多種信號通路參與腫瘤的發生與發展。miR-181家族現有8個成熟序列[8]。近年來的研究結果顯示，miR-181a-5p在多種實體腫瘤組織如宮頸癌[9]、直腸癌[10]、肝癌[11]等組織中異常表達，與腫瘤的發生發展密切相關。miR-181家族受Wnt/β-catenin信號通路以及競爭性內源性RNA等多種機制的調節，從而參與腫瘤的發生發展過程[2,12]。研究顯示，miR-181a-5p在宮頸癌組織中受CCAT1的調控而表達下調，進而上調MMP14表達而促進宮頸癌細胞增殖和侵襲[9]。在直腸癌中，miR-181a-5p的表達受到癌基因CRNDE的抑制，進而激活Wnt通路，促進直腸癌的發生、發展和轉移[10]。然而，有關miR-181a-5p在卵巢癌中的表達尚存在不一致的報道[13-14]，其在卵巢癌中的表達和功能調控可能存在較為復雜的分子機制。本研究結果顯示，miR-181a-5p在卵巢癌組織中低表達，Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者miR-181a-5p的表達高于Ⅲ～Ⅳ期,而且與淋巴結轉移密切相關，提示miR-181a-5p在卵巢癌發生發展中可能發揮抑癌基因的作用，但相關分子調控機制目前尚不明確。

MEST是一種父源性印記基因，主要通過組織特異性及啟動子甲基化調控的印記丟失參與腫瘤的發生與發展[4]。有研究表明，MEST在乳腺癌組織中表達上調，并且能夠促進乳腺癌細胞的增殖過程。敲除乳腺癌細胞內MEST的表達可以降低腫瘤細胞的增殖活性，促進細胞凋亡，MEST的過度表達可以降低ZFP57對Wnt/β-catenin途徑的抑制作用[15-17]。然而，有關MEST在卵巢癌表達及臨床意義尚少見報道。本研究通過檢測HGSOC組織中MEST表達，發現MEST表達水平明顯增高并與miR-181a-5p表達呈顯著負相關，且Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者MEST的表達低于Ⅲ～Ⅳ期患者。結果表明，卵巢癌組織中miR-181a-5p與MEST間似乎存在某種調控關系。本研究再通過生物學分析預測并驗證了miR-181a-5p與MEST之間存在有意義的靶向結合位點，低表達的miR-181a-5p可能失去了對MEST表達的調控作用，進而促進腫瘤的惡性生物學行為。有研究顯示，miR-181a-5p作為抑癌基因可抑制Wnt信號通路的活性，通過調控上皮間質轉化過程進而抑制癌細胞的遷移和侵襲[18-19]，而MEST的高甲基化通過維持β-catenin蛋白穩定表達促進腫瘤發生，也與Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關[5]。另有研究顯示，骨髓間充質干細胞來源的內皮細胞釋放的同家族成員miR-181c可以下調MEST表達，使Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性[20]。結合本研究結果，可以推測miR-181a-5p與MEST間的互作調控可能與Wnt/β-catenin信號通路的活性密切相關，在卵巢癌的發生發展中可能發揮重要作用。

本研究還顯示，miR-181a-5p及MEST的表達水平均與血清中CA125的表達相關，從而為進一步探討兩者聯合血清中CA125檢測在卵巢癌診斷、治療以及隨訪中的作用奠定了基礎。

總之，本研究結果顯示，miR-181a-5p在高級別漿液性卵巢癌中表達下調，可能通過調控MEST表達在腫瘤進展及轉移中發揮抑癌基因的功能。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL26953)。所有試驗過程均遵照《人體醫學研究的倫理準則》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent：All experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Document No.QYFYWZLL26953).All experiments were conducted in accor-dance with The Regulations of The Code of Ethics for Human Medical Research.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：陳晨、田甜、孫文瑜參與了研究設計；陳晨、于嘯、婁艷輝參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions：The study was designed byCHENChen,TIANTian, andSUNWenyu.The manuscript was drafted and revised byCHENChen,YUXiao, andLOUYanhui.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.