扁柏酚對小鼠煙曲霉菌性角膜炎的保護作用及其機制

馬淑芹 王謙 徐強 賀夢婷 林靜

(青島大學附屬醫院眼科，山東 青島 266003)

真菌性角膜炎(fumigatus keratitis, FK)是一種由致病真菌引起的感染性角膜疾病[1]。曲霉菌屬及鐮刀菌屬是發展中國家FK的主要致病菌[2]。目前臨床上常用的抗真菌藥物如那他霉素、伏立康唑等普遍出現耐藥性[3]，因此尋找治療FK安全有效的新型藥物具有重要意義。在FK的發生發展過程中，除真菌的毒力因子(如毒素和蛋白酶等)對角膜造成直接損傷外，真菌在角膜組織中還能誘導強烈的免疫炎癥反應，加重角膜組織損傷[4-8]。目前臨床上抗真菌治療結合免疫調節在真菌感染性疾病治療中效果較好。扁柏酚(HK)是一種天然的卓酚酮衍生物，從柏科植物的樹干中純化而來[9]。既往研究表明，在聚肌胞苷酸刺激的人角膜上皮細胞中，HK可以抑制核轉錄因子-κB的核轉位和促炎炎癥因子的表達，保護角膜上皮細胞免受損傷[10]。在大腦中動脈閉塞誘導的血栓栓塞性卒中大鼠中，HK可以通過抑制炎癥反應和細胞凋亡，起到神經保護的作用[11]。HK抗真菌效果顯著，可以通過阻斷RAS信號傳遞來抑制白色念珠菌的菌絲生長[12]，還能抑制念珠菌生物膜生長[13]。但HK對FK的作用及其作用機制目前尚未見相關研究報道。本研究擬通過動物實驗和體外細胞實驗，探討HK在煙曲霉菌所致FK中發揮的保護作用及其調控機制。

1 材料與方法

1.1 煙曲霉菌培養和HK溶液的配置

取低溫保存的煙曲霉菌標準菌株(菌株3.0772，中國微生物中心)，接種于固體瓊脂培養基后置于28 ℃培養箱孵育，待菌絲覆蓋培養基表面，刮取孢子，用無菌PBS調整孢子終濃度至1×1010CFU/L，分為兩份。一份儲存于4 ℃冰箱備用。另一份接種于裝有無菌沙氏培養基的錐形瓶中，28 ℃下于培養箱內振蕩培養；待菌絲呈圓團狀時，收集菌絲研磨離心，加入體積分數0.75的乙醇滅活菌絲，4 ℃冰箱放置過夜；洗除乙醇后，加入DMEM培養液調整滅活菌絲終濃度至5×109CFU/L。取適量HK粉末溶解于DMSO并調整濃度至32 g/L后儲存，后續通過無菌PBS或者DMEM細胞培養基將HK儲存液稀釋至合適的工作液用于實驗。

1.2 小鼠的分組和處理

8周齡雌性C57BL/6小鼠24只(購于北京斯貝福生物技術有限公司)，隨機分為HK組和對照組，每組12只。小鼠以80 g/L水合氯醛0.08 mL腹腔注射麻醉，于小鼠右眼角膜基質內注入2 μL煙曲霉菌分生孢子混懸液(1×1010CFU/L)，左眼不做任何處理。于小鼠感染真菌后第1天，HK組小鼠給予5 μL HK(10 mg/L)點眼處理，對照組小鼠給予1 g/L DMSO點眼處理，每日3次，兩次點眼間隔4 h。

分別于真菌感染后第1天和第3天使用裂隙燈觀察兩組小鼠右眼角膜炎癥情況，參考相關文獻對小鼠角膜炎癥進行臨床評分[14]，分為Ⅰ～Ⅳ級，分別對應1～4分。于感染真菌后第3天，以頸椎脫臼法處死所有小鼠。收取每組6只小鼠的右眼角膜，置于500 μL無菌PBS中研磨勻漿，取100 μL勻漿液均勻接種于沙氏固體瓊脂培養基中，37 ℃下孵育36 h后，計數菌落形成單位(CFU)數目，每組重復6次，依據角膜CFU數目定量分析角膜真菌負荷量。收取每組另外6只小鼠眼球，包埋于OCT包埋劑中，液氮速凍后使用冰凍切片機(-25 ℃)10 μm厚切片，切取位置為角膜中央部位。每只小鼠的切片分為3份，一份進行HE染色，一份進行過碘酸希夫(PAS)染色，均于光學顯微鏡下觀察并拍照記錄；另外一份切片進行巨噬細胞免疫熒光染色，使用熒光顯微鏡觀察拍照。以上實驗步驟均嚴格按照產品使用說明書操作。

1.3 細胞培養及處理

將小鼠RAW264.7巨噬細胞(購買于中國科學院細胞庫)置于37 ℃含體積分數0.05 CO2的DMEM細胞培養液中，接種在12孔細胞培養皿中培養。待細胞密度達到約80%時，C組給予1 g/L DMSO預處理2 h，D組和E組細胞分別給予濃度8、16 mg/L的HK預處理2 h，A組和B組細胞不做預處理；上述處理完成后分別于B～E組每孔細胞中加入滅活菌絲60 μL處理8 h。然后收集各組細胞，采用Trizol法提取常規培養的細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,并以此為模板進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。根據試劑盒說明書配制反應體系,以β-actin作為內參照,每個樣品設置4個復孔，結果取均值，實驗重復3次。采用2-△△CT法計算樣本當中IL-1β、MCP-1、CXCL-1以及Dectin-1 mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.4 統計學處理

采用SPSS 統計軟件對實驗數據進行分析。各組間比較采用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組小鼠角膜炎癥情況比較

裂隙燈圖像顯示，在煙曲霉菌感染后第1天，HK組與對照組小鼠角膜炎癥程度無明顯差別(圖1A、B)；煙曲霉菌感染后第3天，與對照組相比，HK組小鼠的角膜混濁面積明顯減少，潰瘍程度明顯減輕，角膜透明度明顯增加(圖1C、D)。HE染色結果顯示，與對照組相比，HK組小鼠角膜在煙曲霉菌感染后第3天炎癥細胞數量明顯減少，潰瘍程度明顯減輕(圖1E、F)。對照組和HK組小鼠第1天角膜炎癥的臨床評分分別為5.67±0.52、5.83±0.41，第3天角膜炎癥的臨床評分分別為7.67±0.52、5.33±0.52。重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、分組以及時間和分組的交互作用對小鼠角膜炎癥的臨床評分均有明顯影響(F時間=19.29，F分組=22.84，F交互作用=53.57，P<0.05)；單獨效應分析，第3天對照組小鼠角膜炎癥臨床評分與第1天相比明顯提高(P<0.05)，在第3天HK組小鼠角膜炎癥的臨床評分與第1天相比較無明顯變化(P>0.05)；兩組小鼠角膜炎癥臨床評分在煙曲霉菌感染后第1天無顯著差異(P>0.05)，感染第3天HK組小鼠角膜炎癥臨床評分較對照組顯著降低(P<0.05)。

A、B分別為對照組和HK組小鼠感染后第1天裂隙燈圖像，C、D分別為對照組和HK組小鼠感染后第3天裂隙燈圖像，E、F分別為感染后第3天對照組和HK組角膜組織HE染色圖像(400倍)

2.2 兩組小鼠角膜真菌負荷比較

結果顯示，煙曲霉菌感染后第3天，對照組和HK組小鼠角膜CFU計數分別為329.00±28.76、98.17±6.77，兩組比較差異具有顯著的意義(F=366.23，P<0.05)。角膜組織切片的PAS染色結果顯示，在感染后第3天，對照組角膜基質層可見較多煙曲霉菌菌絲(圖2A)，HK組角膜基質層菌絲含量較對照組顯著減少(圖2B)。

A、B分別為對照組和HK組小鼠感染后第3天PAS染色結果(400倍)，其中右下角圖為放大的角膜基質(800倍)，白色箭頭指示煙曲霉菌菌絲

2.3 兩組小鼠角膜組織中巨噬細胞浸潤情況比較

小鼠角膜組織的巨噬細胞免疫熒光染色結果顯示，煙曲霉菌感染后第3天，兩組小鼠角膜基質中均有大量巨噬細胞浸潤，與對照組相比，HK組角膜組織中巨噬細胞浸潤數量顯著減少(圖3)。其中圖中綠色圖像為使用F4/80-FITC標記的巨噬細胞，藍色圖像為使用DAPI標記的細胞核，Merge指示巨噬細胞在角膜組織中的定位。

A、B分別代表感染后第3天對照組、HK組小鼠角膜巨噬細胞免疫熒光染色結果(400倍)

2.4 各組細胞IL-1β、MCP-1、CXCL-1和Dectin-1 mRNA表達水平比較

RT-qPCR檢測的結果顯示，各組細胞IL-1β、MCP-1、CXCL-1及模式識別受體Dectin-1 mRNA的相對表達水平進行比較，差異具有顯著意義(F=90.80～370.57，P<0.05)，其中B組顯著高于A組(P<0.05)，B組與C組間比較沒有明顯差異(P>0.05)，D、E組明顯低于B組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞IL-1β、MCP-1、CXCL-1和Dectin-1 mRNA表達水平比較

3 討 論

FK是由致病真菌引起的一種高度致盲的感染性眼病[15]。致病真菌的侵襲性強、毒力大，可介導機體產生各種趨化因子及炎癥因子，招募炎癥細胞向感染部位聚集[16]。過度的免疫炎癥反應，常常會造成嚴重的角膜損傷，嚴重者可導致角膜穿孔[17-18]。HK是一種在柏科植物中發現的天然卓酚酮類衍生物，具有廣泛的抗真菌及抗炎作用[19]。

本研究結果顯示，與對照組相比，HK處理煙曲霉菌感染的小鼠角膜3 d后，角膜混濁面積減少，潰瘍程度減輕，角膜透明度增加，臨床評分顯著降低。HE染色結果也顯示HK處理的小鼠角膜炎癥細胞數量減少，潰瘍程度減輕。提示HK能夠減輕煙曲霉菌致角膜炎的炎癥反應，降低角膜損傷。煙曲霉菌在侵襲角膜的過程中，可以通過其黏附素黏附于角膜上皮基底膜、膠原等成分上，其分泌的磷脂酶可造成宿主上皮細胞膜損傷，進而導致細胞腫脹、壞死[20]。因此，降低角膜真菌負荷量能夠減輕角膜炎癥程度。體外實驗研究顯示，HK對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有顯著抑菌作用[12-13,21]。HK可以顯著降低肺炎鏈球菌肺炎模型小鼠肺部細菌負荷[22]。在本研究中，使用HK處理煙曲霉菌感染的小鼠角膜，在感染后第3天小鼠角膜真菌殘存量顯著降低。提示HK能有效抑制煙曲霉菌的生長，從而減輕角膜煙曲霉菌感染癥狀。

巨噬細胞是FK感染過程中免疫應答的重要成分，其能夠識別并吞噬病原體，誘導ROS、一氧化氮等抗真菌物質的產生，從而直接殺傷真菌，還可以誘導各種炎癥因子的產生，介導免疫細胞的進一步活化[23-24]。巨噬細胞所產生的這些抗真菌物質在清除真菌的同時，也能溶解角膜基質，導致角膜組織壞死和膿腫發生[25]。既往研究表明，在銅綠假單胞菌感染性角膜炎小鼠模型中，向角膜內注射乳膠微粒活化巨噬細胞后，小鼠角膜炎癥程度顯著加重，過量的巨噬細胞浸潤還會導致角膜穿孔[26]。本研究對真菌感染的小鼠角膜給予HK處理后，檢測巨噬細胞在角膜基質中的浸潤程度，結果顯示HK組小鼠角膜基質中巨噬細胞的浸潤數量較對照組明顯減少，提示HK抑制了巨噬細胞在角膜組織中的募集，從而在FK中發揮抗炎作用。為了觀察HK能否調控巨噬細胞中炎癥相關因子的產生，本研究分別使用DMSO和不同濃度的HK預處理RAW264.7巨噬細胞，再加入煙曲霉菌滅活菌絲刺激上述細胞，檢測各組細胞炎癥因子和趨化因子表達的變化。結果示HK預處理組RAW264.7細胞中IL-1β、MCP-1、CXCL-1的表達水平與對照組比較明顯降低，提示HK能抑制煙曲霉菌誘導的巨噬細胞中炎癥因子和趨化因子的表達，從而進一步減少免疫細胞的募集。LU等[27]研究顯示，HK通過抑制肝組織中炎癥因子的表達，可有效防止出血性休克及復蘇后的肝損傷。LEE等[28]研究顯示，HK能通過抑制脂多糖誘導的原代人角質形成細胞中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表達水平，從而減輕皮膚炎癥損傷。上述研究與本研究結果一致。在FK中，Dectin-1受體的激活可以誘導大量炎癥因子和趨化因子，進而促進巨噬細胞和中性粒細胞的進一步激活以及ROS的產生，加速炎癥級聯反應[29]。為了進一步探究HK在FK中發揮抗炎作用的機制，本研究檢測了煙曲霉菌感染后RAW264.7巨噬細胞中Dectin-1的表達。結果顯示HK預處理組Dectin-1的基因表達較對照組明顯降低。提示當角膜受到煙曲霉菌感染時，HK可通過抑制Dectin-1 mRNA表達及其介導的下游炎癥反應來抑制過度炎癥反應的發生。

綜上所述，本研究結果顯示,HK在煙曲霉菌性角膜炎中具有抗真菌和抑制炎癥的作用，其作用機制為，一方面HK可減少角膜真菌負荷量，另一方面HK能夠抑制巨噬細胞募集以及Dectin-1受體介導的下游炎癥級聯反應。本研究結果為進一步探索HK針對FK的臨床試驗提供了理論依據和實驗數據。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫院動物倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL-26776)。所有實驗過程均遵照美國眼科和視覺研究協會(ARVO)關于在眼科和視覺研究中動物使用的原則和標準進行。

EthicsApprovalandAnimalRight：All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Ethics Committee on Experimental Animals of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Approval Letter No.QYFYWZLL26776), and all experimental animal protocols were carried out by The Guidelines of The Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)State-ment for The Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research.

作者貢獻：馬淑芹、賀夢婷、林靜參與了研究設計；馬淑芹、王謙、徐強參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions：The study was designed byMAShuqin,HEMengting, andLINJing.The manuscript was drafted and revised byMAShuqin,WANGQian,andXUQiang.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.