染色體核型聯合CNV-seq對羊水嵌合體的診斷分析

黃柳萍 梁莊嚴 吳偉彪 魏楚洪 羅小芳 吳海燕 郭潤民 趙卓姝▲

1.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院醫學遺傳實驗室，廣東佛山 528300；2.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院新生兒疾病篩查中心，廣東佛山 528300；3.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院產前診斷中心，廣東佛山 528300

在產前診斷工作中經常遇到嵌合體的情形，如何準確判斷所觀察到的嵌合現象屬于真性嵌合還是假性嵌合，是困擾每一個產前診斷醫生的難題。染色體核型是一種傳統方法，通過計算核型的數量算出異常核型的比例來分辨嵌合體，該方法受培養過程的影響，也無法發現<5 Mb 的染色體異常，具有局限性。拷貝數變異測序（copy number variations-sequencing，CNV-seq）檢測不需要進行細胞培養，分辨率高，但是無法檢出純合區域、單親二倍體和染色體結構異常[1]。因此，兩種方法的結合理論上可提高羊水嵌合體的診斷準確率。本研究納入染色體核型聯合CNV-seq 診斷嵌合體的病例，分析其診斷結果，為產前診斷中羊水嵌合體的診斷提供數據和經驗支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年6月因各種高危因素于廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（我院）產前診斷中心就診并進行產前診斷的孕婦3163 例作為研究對象，收集所有的羊水染色體核型分析結果或CNV-seq 結果為嵌合體的病例進行分析。所有入選孕婦均簽署知情同意書，該研究得到我院產前診斷中心醫學倫理委員會批準。納入標準：①單胎妊娠且孕周16～24 周；②有明確產前診斷指征，包括高齡、超聲異常、唐氏篩查異常、不良孕產史等。排除標準：①多胎妊娠；②孕周<9 周；③近幾個月有先兆流產者；④其他侵入性產前診斷有禁忌證者。所有入選孕婦接受由具有遺傳咨詢資質的臨床醫生提供詳細遺傳咨詢，建立遺傳咨詢病例，記錄孕婦的臨床相關信息。所有孕婦均在超聲定位后，在無菌條件下經腹壁行羊水穿刺術，取羊水20～25 ml 進行相關檢測。

1.2 染色體核型分析

羊水離心后去上清，細胞懸液置于37℃ 5%CO2培養，帶羊水細胞貼壁鏡下見多個克隆即可進行收獲。常規制片，G 顯帶，根據標準[2]，計數不少于20 個分裂相，分析5 個核型。根據人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）對所檢染色體進行命名，依據判讀指南對染色體結果進行分析和判讀[3]。

1.3 CNV-seq檢測

按照DNA 提取，DNA 文庫構建與測序，生物信息學分析的流程進行CNV-seq 檢測，分析并記錄相關數據。

1.4 統計學分析

使用SPSS 22.0 統計學軟件進行統計分析，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗進行比較，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羊水嵌合體檢出率

3163 例羊水檢出嵌合體43 例，檢出率為1.36%，其中染色體核型檢出嵌合體40 例，檢出率為1.26%，CNV-seq 檢出嵌合體20 例，檢出率為0.63%，染色體核型對嵌合體的檢出率顯著高于CNV-seq 對嵌合體的檢出率（χ2=6.731，P=0.009）。

2.2 染色體核型聯合CNV-seq對嵌合體的診斷

如表1所示，染色體核型與CNV-seq 檢測結果相符率為39.53%（17/43），其中性染色體相符率為52.38%（11/21，21 為性染色體嵌合的病例數），大部分為45，X 嵌合體；常染色體相符率為27.27%（6/22，22 為常染色體嵌合的病例數），有8、12、13、16、21 號染色體嵌合。如表2所示，檢測結果不相符26 例，其中10 例性染色體嵌合，最多的是45，X嵌合體，其次是47，XXX 嵌合體；16 例常染色體嵌合，有5、9、10、14、18、20、21 號染色體嵌合，而最多的是18 和21 號染色體嵌合。

表1 染色體核型與CNV-seq檢測羊水嵌合體結果相符病例

表2 染色體核型與CNV-seq檢測羊水嵌合體結果不相符病例

3 討論

產前診斷過程中經常遇到嵌合體的情形，胎兒整個機體存在兩種或以上的細胞系，稱之為真性嵌合體，除此之外還經常因為母血污染、培養過程中的細胞畸變等原因出現假性嵌合體的情況[4-5]，可能會錯誤地引導孕婦引產，所以正確地分辨真假嵌合非常重要。目前，分辨真假嵌合主要有四種方法：①染色體核型分析。通過計數核型的數量算出異常核型的比例來分辨嵌合體。這種判斷真假嵌合體的方法有個巨大的缺陷，有可能是異常細胞產生了畸變后進入羊水中，從而培養物中出現多種異常染色體核型，而誤診為真性嵌合體，也有可能是體外培養或制片過程中的染色體畸變的細胞較多，從而異常集落較多而誤診為真性嵌合體[6-7]。②通過孕晚期臍血細胞染色體核型分析來驗證或者結合超聲結果綜合判斷。相關研究表明，羊水嵌合體發生率在0.29%左右，用胎兒組織或臍血來驗證，真嵌合體的比率只有62.5%[8]，而對性染色體嵌合的研究表明[9]，用臍血來驗證羊水性染色體嵌合，真性嵌合體只占47.8%（11/23）。張玲玲等[10]推薦在孕晚期采集臍血進行復查，并結合超聲結果排除妊娠假性嵌合體，取得一定效果。該方法具有明顯的弊端，首先采集臍血具有一定的概率流產，增加了孕婦的風險，其次當發生低比例嵌合或性染色體嵌合時，超聲影像不能及時診斷[11]。③用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）驗證。付玉榮等[12]將FISH 應用于產前嵌合體的輔助診斷，8 例染色體核型嵌合體結果中有3 例與FISH 結果不一致。FISH 將熒光素標記核酸探針與待測樣本中的核酸序列雜交，實驗周期短，成功率高，但是特異性探針價格高，并不是所有醫療機構都有條件開展該項目，探針的局限性也決定其不能對染色體結構異常進行檢測[13]，從而限制了該技術的應用。④應用CNV-seq 檢測嵌合體，理想條件下可檢測出低至5%的染色體非整倍體嵌合，臨床條件下可檢出超過10%的染色體非整倍體嵌合[14]，同時可以客觀地檢測出微缺失、微重復，不像核型分析那樣主觀觀察和判斷，可精確檢測低至10～50 ng 的DNA 樣本，具有很強的臨床適用性。

本研究納入染色體核型聯合CNV-seq 診斷嵌合體的病例，分析結果顯示，染色體核型和CNV-seq結果相符率只有39.5%（17/43），其中性染色體相符率為52.38%（11/21），崔科等[15]研究發現染色體核型聯合CNV-seq 檢測性染色體嵌合體的符合率為78.57%，雖高于本研究結果，但符合率仍有待提高。常染色體相符率僅為27.27%（6/22）。染色體核型檢出而CNV-seq 未檢出的原因很可能是因為低比例嵌合超出CNV-seq 的檢測下限，特別是常染色體嵌合，染色體核型檢出的嵌合比例都在6%以下（19、23 號病例除外，可能是細胞培養過程中異常細胞優勢生長，或是染色體制片過程中隨機收獲到了更多的異常細胞，導致嵌合比例假性增高），18號病例mos 45，X[25]/46，X，psu dic（X）（q25）[31]屬于X 單體嵌合結構異常的psu dic（X），整體數量還是相當于兩條X 染色體，因此CNV-seq 不能檢出。染色體核型未檢出而CNV-seq 檢出的嵌合體病例有3 例，均為常染色體嵌合，常染色體異常的細胞培養可能生長過程緩慢，所以導致染色體核型未檢出而CNV-seq 檢出。可見，染色體核型聯合CNV-seq 診斷嵌合體，可確認一部分真性嵌合（檢測結果一致時），可檢出傳統染色體核型未檢出的嵌合體（病例28、29、30）。還有一部分檢測結果不相符的病例可懷疑假性嵌合，可通過FISH 驗證或孕晚期采集臍血進一步驗證。從嵌合比例的分布上看，43 個病例中，染色體核型檢出嵌合比例≥10%的病例有15例，其中13例與CNV-seq檢測結果相符，2 例不相符；染色體核型檢出嵌合比例<10%的病例有28 例，其中只有4 例與CNV-seq 檢測結果相符，24 例不相符；可見低比例嵌合更容易造成檢測結果不相符，更需要不同的方法來相互驗證。CNV-seq 檢出嵌合比例≥10%的病例有20 例，其中17 例與染色體核型檢測結果相符，3 例不相符；而CNV-seq 檢出嵌合比例<10%的病例為0，可能是臨床條件下CNV-seq很難檢出<10%的嵌合，與前人研究結果相符[14]。

本研究納入嵌合體病例數量有限，有待進一步納入更多病例以豐富臨床數據。嵌合體的診斷一直是產前診斷中的難題，隨著新技術的發展，可將染色體核型、CNV-seq、FISH、基因芯片等更多的技術應用于產前嵌合體的診斷中，將會獲得更準確的結果。本研究通過染色體核型和CNV-seq 的聯合診斷，提前確認真性嵌合，避免孕婦后期復查臍血，減少孕婦焦慮，為產前診斷與遺傳咨詢工作提供巨大幫助。