iRGD修飾的外泌體攜載阿霉素對U87MG膠質瘤細胞的療效研究

孫雷濤 劉立云 張文生

濱州醫學院附屬醫院神經外科，山東濱州 256600

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是臨床最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，具有高復發率、高增殖率及局部復發侵襲等特點。目前膠質母細胞瘤的治療原則為在盡可能保留神經功能的基礎上全切腫瘤，術后輔以放化療等綜合治療[1]。然而由于血腦屏障和血瘤屏障的存在，化療藥物選擇性低、滲透能力弱、入胞效率低及耐藥性等限制了化療效果。外泌體（exosomes）作為新型的藥物攜載體，體積小、易通過血腦屏障，同時還能進行膜修飾從而增強細胞特異性靶向作用。在免疫反應、安全性上有很大的優勢[2]。本研究運用體外修飾的外泌體作為阿霉素的載體，通過靶向修飾攜載化療藥物快速、高效、靶向地輸送至膠質瘤細胞，增強細胞親和力，減少非靶部位的聚集，抑制膠質瘤細胞的體外增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

U87MG 細胞系（中科院上海細胞生物學研究所）；轉染試劑（美國Invitrogene 公司），引物由上海生工設計合成，阿霉素（美國Sigma 公司），熒光染劑PKH67（美國Invitrogen 公司），電穿孔儀（美國Invitrogen 公司），激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 凱基DMEM 完全培養基用于細胞培養，待U87MG 細胞融合程度達到85%～90%時進行細胞的傳代培養，收集第6～8 代的細胞用于后續的實驗。培養條件為37℃、5% CO2。

1.2.2 具有靶向作用外泌體的表達載體pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD 的 構 建 以LAMP2 cDNA為模板設計引物：LAMP2 Xhol 上游引物序列：TCTCGAGATGGTGGTGTGCTTCCGCCT，LAMP2 Xhol下游引物序列：AACTAGTAAATTGCTCATATCCAGC。通過PCR 將Flag-iRGD 序列插入LAMP2 cDNA 的3’端，獲得LAMP2-Flag-iRGD 融合基因，通過酶切，將該融合基因克隆至pCDNA3.1 真核表達載體中，獲得載體pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD。

1.2.3 U87MG 細胞轉染 應用轉染試劑（Lipofectamine 3000）將質粒轉染入U87MG 膠質瘤細胞（空白轉染組：pCDNA3.1/LAMP2；iRGD 靶向轉染組：pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD）。將A 液、B 液混勻后懸滴加入六孔板中，標記空白轉染組、iRGD 靶向轉染組，將培養板搖動并輕輕混勻。6 h后更換去外泌體完全培養基。

1.2.4 外泌體的提取 去外泌體完全培養基（超速離心120 000 g，16 h）繼續培養24 h 后收集上清，提取外泌體。反復超速離心后沉淀即為外泌體和雜質蛋白；最后用PBS 將沉淀重懸后繼續在4℃下100 000 g 離心70 min，最后得到的沉淀即為細胞外泌體。分別獲得空白轉染-外泌體（blank-exo）組和iRGD-外泌體（iRGD-exo）組。

1.2.5 藥物包裝 將純化的外泌體與阿霉素在PBS 中混合，將混合物在37℃搖動溫育1 h，然后添加到冷卻的4 mm 電穿孔比色杯中，用Eppendorf Eporator 在1 kV 下電穿孔混合物20 ms，分別獲得空白轉染-外泌體-阿霉素（blank-exo-dox）組、iRGD-外泌體-阿霉素（iRGD-exo-dox）組。

1.2.6 iRGD 的RT-PCR 檢測 取凍存blank-exo組、iRGD-exo 組抽提RNA，進行反轉錄PCR 反應（iRGD 上游引物序列：5’-TCGATGTTAGACCTGG AAATAGTGGTGCTGTG-3’，iRGD 下游引物序列：5’-CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA-3’，GAPDH 設為內參）。

1.2.7 激光共聚焦觀察細胞對外泌體的攝取及阿霉素的胞內濃度 PK67 分別標記blank-exo-dox組和iRGD-exo-dox 組，標記的外泌體沉淀用過濾PBS 重懸洗滌，將兩組懸液分別懸滴加入U87MG細胞培養皿中，共孵育2 h 后，用PBS 液清洗并去除多余外泌體，分別得到blank-exo-dox-U87MG 和iRGD-exo-dox-U87MG。激光共聚焦下觀察細胞對外泌體的攝取情況及外泌體攜載阿霉素進入細胞的情況。

1.2.8 細胞增殖檢測 將blank-exo-dox-U87MG和iRGD-exo-dox-U87MG 細胞分別接種于96 孔板，37℃、5% CO2培養0、24、48、72 h，然后加入10 μl的CCK-8 溶液后繼續培養1～4 h，在450 nm 處用酶標儀測定觀察吸光度。

1.3 統計學方法

使用SPSS 24.0 統計學軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（）表示，比較采用獨立樣本的t檢驗及單因素方差分析，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 iRGD-外泌體鑒定

通過RT-PCR 觀察iRGD 修飾組mRNA 的表達水平。結果顯示，細胞轉染pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD 后獲取的外泌體中iRGD mRNA 高表達，而blank-exo 組未見表達（圖1）。

2.2 iRGD-外泌體-阿霉素靶向U87MG細胞并增加胞內阿霉素濃度

iRGD 能夠與膠質瘤細胞上αν 整合素靶向結合，共孵育后激光共聚焦觀察發現iRGD-exo-dox 組與膠質瘤細胞的結合率為（45.60±9.15）%，顯著高于blank-exo-dox 組的（9.20±3.46）%，差異有統計學意義（t=6.428，P=0.003）。說明通過以多肽為標靶的iRGD 顯著增強了外泌體對U87MG 細胞的靶向能力（圖2）。iRGD-exo-dox 組阿霉素主要聚集在U87MG 細胞核內，而在對照組，阿霉素富集低得多，且多位于細胞周邊（圖3）。

2.3 iRGD-外泌體-阿霉素抑制U87MG細胞增殖

通過CCK-8 分別檢測blank-exo-dox 組和iRGD-exo-dox 組在24、48、72 h 時細胞的生長情況。blank-exo-dox 組在450 nm 處OD 值分別為（0.91±0.13）、（0.79±0.11）和（0.67±0.08）。iRGD-exo-dox組 在450 nm 處OD 值 分 別 為（0.55±0.12）、（0.34±0.08）和（0.17±0.06）。iRGD-exo-dox 組抑制率分別為（52.33±8.94）%、（70.15±6.20）% 和（87.16±13.01）%，但blank-exo-dox 組抑制細胞增殖能力較弱，分別為（18.41±3.69）%、（27.82±5.10）%和（37.31±6.39）%，兩組同一時間點比較差異均有統計學意義（P< 0.05），表明iRGD-exo-dox 高效靶向U87MG 細胞后通過增加胞內阿霉素濃度顯著抑制了細胞增殖（圖4）。

3 討論

腦膠質瘤術后化療對延長患者生存的意義重大，但目前總體治療效果仍不甚理想[3-4]。影響化療效果的原因主要為血-腦屏障的存在和腫瘤細胞的耐藥性及免疫逃逸[5]。膠質瘤中存在的腫瘤干細胞有多種分化能力，有良好的免疫逃逸機制，耐藥機制較為復雜。目前，傳統化療藥物特異性差、耐藥率高、人體毒性作用強，越來越多的研究集中于藥物的靶向性及耐藥機制的研究[6]。因此尋找小分子量、高穿透性藥物載體來提高局部藥物濃度及靶向作用，成為目前研究的熱點。

傳統細胞靶向載體存在運載效率低，具有免疫原性易被清除，缺乏靶向性等問題，難以實現對藥物攜載的穩定性和特異性。外泌體作為30～100 nm的脂質雙分子囊泡，攜帶蛋白及核酸物質，在免疫反應、安全性上有很大優勢：體積小，易通過血腦屏障；作為一種膜結構載體，通過膜融合方式直接送入靶細胞中，投遞效率更高。不僅在體內、體外均可以加載基因和藥物，同時還能進行細胞膜的修飾從而增強細胞抗原特異性的靶向作用。外泌體有望成為化療藥物的“金載體”[7]。

國外有研究發現外泌體通過攜載β 分泌酶siRNA 后外泌體的血腦屏障穿透率明顯提高，而且腫瘤周圍的小膠質細胞、少突膠質細胞甚至神經元中BACE1 的表達均顯著抑制[8]。近年來，關于外泌體中內容物表達的研究進一步揭示了腦膠質瘤的侵襲轉移機制，為腦膠質瘤的化療耐藥機制研究、免疫治療、靶向治療等開闊了思路[9]。有研究在斑馬魚膠質瘤模型中發現，大腦內皮細胞來源的外泌體作為載體可以攜帶抗腫瘤藥物穿過血腦屏障，治療多種中樞神經系統惡性腫瘤包括膠質瘤[10]。有研究在膠質瘤中，證明了組建的工程外泌體能夠順利通過血腦屏障，不僅具備良好的靶向治療效果，毒副作用明顯降低[11]。

研究已證實整合素ανβ3 在膠質瘤的血管生成過程中表達增加，而且在膠質瘤細胞株細胞膜上也高表達[12]。有研究應用RGD 序列多肽作為PET-CT 檢查的顯像劑來觀察不同腫瘤細胞的結合特性，結果顯示：膠質瘤對RGD 的攝取率>肝癌、胰腺癌>腸癌、子宮頸癌[13]。有研究發現，iRGD 能特異識別腫瘤細胞和腫瘤內新生血管的內皮細胞中表面高表達的整合素ανβ3 分子[14]。理論上iRGD-外泌體-阿霉素藥物載體就可以攜帶阿霉素快速、高效、靶向地輸送至膠質瘤細胞內和瘤內血管內皮細胞，減少其非靶部位的聚集。

雖然阿霉素作為常用的抗腫瘤藥物，在多種惡性腫瘤的治療中應用，但由于其劑量毒性及血腦屏障的限制，在中樞神經腫瘤的應用較少[15]。目前有研究者提出了外泌體作為化療藥物（紫杉醇和阿霉素）和中藥姜黃素的運載工具，提高藥物治療效果[16]。充分設計和利用人自身納米級的藥物載體，不僅具有良好的免疫原性，同時具備良好的靶向轉載藥物能力，表現出了良好的應用前景[17]。在本研究中通過轉染iRGD 的外泌體包裹阿霉素成功構建了藥物載體，作用于U87MG 細胞后表現出良好的靶向性，并且能夠顯著抑制U87MG 細胞的增殖。

目前大量的實驗研究發現，外泌體同時參與了細胞間的通訊、免疫應答、免疫豁免等細胞功能，因此，在惡性腫瘤的發生發展各個病理階段均有參與[18]。近年來外泌體作為基因表達調控、免疫穩態維持、細胞通信等方面的研究熱點，取得了一定的進展，但中樞神經系統腫瘤中外泌體的研究仍處于起步階段[18-19]。目前研究認為建立特殊的實驗模型、大通量基因組學及蛋白組學中探尋特異性液體活檢靶向分子、開發新的外泌體-抗腫瘤藥物載體是未來中樞神經系統腫瘤外泌體研究的方向和重點[20]。