活血生骨湯治療激素性股骨頭壞死的分子機制研究

李 楠 董汝軍

山東省聊城市中醫醫院骨科，山東聊城 252000

大劑量長期或短期沖擊應用糖皮質激素類藥物引起股骨頭周圍靜脈回流不暢、動脈血供不足是激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）的主要發病原因[1-2]。隨著糖皮質激素類藥物在臨床上的廣泛應用，SONFH的發病率逐年攀升，已經成為臨床最常見的非創傷性股骨頭壞死類型[3]。SONFH 病程發展迅速，并且伴隨著嚴重的髖關節疼痛和疾病后期股骨頭塌陷造成的髖關節骨性關節炎。因此，SONFH 的發病機制與治療方式已經成為骨科領域學者的研究熱點。

隨著對SONSH 研究的不斷加深，中醫藥防治SONFH 取得的療效受到廣泛關注。SONFH 的中醫病機為腎虛血瘀、骨枯髓消，根據辨證論治的中醫理論特點，臨床多采用補腎活血、生骨祛瘀類藥物相互配伍。活血生骨湯（專利申請者：李楠，專利題名：活血生骨湯，國別：中華人民共和國，專利號：ZL201410684814.1，授權公告號：CN 104474128 B，專利發布日期：2018年8月14日）是本課題組前期研究中已獲得國家專利的治療SONFH 的臨床經驗方，由當歸、川芎、牛膝、防己、赤芍、丹參、茯苓、枸杞子、紅花、木香、鹿角膠、淫羊藿、羌活、獨活、白芷、伸筋草、骨碎補、杜仲、甘草等藥物組成，其中丹參活血祛瘀，主治氣滯血瘀之征，淫羊藿補腎壯陽，二者合用，起到活血祛瘀、補腎壯骨之功效。紅花、當歸、川芎、鹿角膠、杜仲、枸杞、牛膝發揮活血通絡、補益肝腎的功效。骨碎補、赤芍、茯苓散瘀消腫、緩急止痛，獨活、羌活、防己、白芷可祛風止痛，木香行氣止痛，伸筋草祛風濕、舒筋活絡，諸藥合用可改善局部疼痛、活動受限等癥狀，共奏補腎活血、生骨祛瘀之功效。為了進一步闡釋活血生骨湯治療SONFH 具體的藥理學作用與分子機制，本研究基于生物信息學與網絡藥理學研究方法，整合篩選高通量數據，并采用分子對接技術驗證潛在有效成分與核心靶點的結合活性，探討活血生骨湯治療SONFH 的分子機制。

1 資料與方法

1.1 獲取與篩選藥物成分

借助BATMAN-TCM 藥物成分數據庫[4]（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），以“當歸、川芎、牛膝、防己、赤芍、丹參、茯苓、枸杞子、紅花、木香、鹿角膠、淫羊藿、羌活、獨活、白芷、伸筋草、骨碎補、杜仲、甘草”作為檢索詞，檢索活血生骨湯的有效活性成分及相關潛在靶點。參數設置“藥物-靶點”相似性模型分數Score cutoff ≥20，AdjP-value ≤0.05，分析篩選獲得活血生骨湯的有效活性成分及相關潛在靶點。

1.2 獲取疾病差異基因

利用基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO），檢索詞“steroid-induced osteonecrosis of the femoral head”，篩選并下載SONFH 相關芯片GSE123568 原始數據。使用R 語言Affy 軟件包及limma 軟件包進行強制歸一化處理，并篩選差異表達基因，設置差異倍數（fold change，FC）為|log2FC|≥1，P值<0.01，采用heatmap 軟件包繪制聚類圖。

1.3 構建PPI蛋白互作網絡并分析

借助STRING 數據庫（http: /string-db.org/），構建本研究的關鍵靶點的蛋白相互作用網絡。物種設置為“Homo sapiens”，最大置信數值（highest confidence）設置為0.7。獲得的數據映射處理后導入Cytoscape 軟件，利用Cytoscape 軟件完成PPI蛋白互作網絡的網絡拓撲分析，根據度值（degree，DC）確定網絡核心靶點。

1.4 KEGG與GO功能富集分析

利用Metascape 數據庫[5]（http: //metascape.org/）完成關鍵靶點的批量基因分析，進行基因本體論（gene ontolog，GO）生物學過程功能富集分析及京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析。通過參考錯誤發現率（false discovery rate，FDR）與P值過濾富集結果，輸出結果的氣泡圖。

1.5 分子對接驗證

根據PPI 蛋白互作網絡，選擇度值（DC）的前10 位作為核心靶點，通過計算結合能量、明確結合鍵位的方式，確定相關藥物潛在有效成分的結合活性。

通過PDB 數據庫[6]（http: //www.rcsb.org/）獲得靶點蛋白的蛋白結構文件，設置物種為“Homo sapiens”，選擇解析度較小的蛋白結構文件。通過Pymol 軟件完成修飾操作后導入Auto dock 軟件，經過計算電荷數等一系列操作后，后以pdbqt 格式導出。最終借助Autodock Vina 軟件完成分子對接的計算過程，獲得結合能數值。根據結合能數值確定最優結合構象。利用PyMOL 軟件及PLIP 數據庫[7]（https: //plip.biotec.tu-dresden.de/）可視化對接結果。

2 結果

2.1 活血生骨湯的潛在活性成分與靶點預測

通過BATMAN-TCM 數據庫檢索及條件篩選后，共獲得活血生骨湯組方中潛在有效成分561 個，數據庫預測潛在有效成分作用靶點1263 個。

2.2 SONFH的差異基因

通過GEO 數據庫獲得芯片GSE123568 數據。芯片共納入了30 個SONFH 患者樣本及10 個空白對照樣本。借助R 語言分析工具共獲得717 個差異表達基因，其中上調基因數為431 個，下調基因數為286 個。聚類圖結果見圖1。

2.3 PPI蛋白互作網絡分析

將2.1 與2.2 所獲得的靶點映射處理，共獲得74 個共有靶點，結果見圖2。利用STRING 數據庫構建活血生骨湯治療SONFH 的PPI 蛋白互作網絡。PPI 蛋白互作網絡中共有節點50 個，蛋白互作關系88 條，其中，度值由高到低排序前十位的靶點分別為MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2，將其定義為此PPI 網絡中的核心靶點。PPI 蛋白互作網絡見圖3。

2.4 富集分析結果

本研究通過Metascape 數據庫完成上述PPI 蛋白互作網絡靶點的富集分析。GO 功能生物學進程分析結果顯示，相關靶點在氧化應激反應、細胞的分化與遷移、細胞對激素的刺激反應、藥物代謝、免疫系統的正向調節和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯的調節等生物學進程上顯著富集。KEGG 信號通路分析結果顯示，活血生骨湯治療SONFH 的可能關鍵靶點主要富集于催產素信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、Notch 信號通路、破骨細胞分化信號通路、鈣信號通路及TNF 信號通路等信號通路，富集分析結果見圖4。

2.5 分子對接結果

選取PPI 網絡中前5 位關鍵靶點完成分子對接驗證。分子對接技術中，大分子與小分子配體的結合能越低，則其互相產生穩定結合相互作用的可能性越大。本研究分子對接結果顯示，關鍵靶點與潛在活性成分的結合能均<-5 kCal/mol，產生穩定結合相互作用的可能較大。見表1，對接可視化結果見圖5。

表1 活性成分與關鍵靶點對接結果

3 討論

隨著糖皮質激素類藥物廣泛應用于臨床疾病治療，糖皮質激素引發的繼發性疾病開始受到關注。其中，SONFH 已經成為股骨頭壞死臨床最為常見的類型，發病率居非創傷性股骨頭壞死首位。流行病學調查結果顯示，我國SONFH 發病率占24.1%[8]。基于國內外股骨頭壞死領域研究的不斷深入，對于SONFH 的致病原因已經較為明確，但其病理生理學機制尚不清楚。現階段較為公認的血管活性因子異常表達學說認為，由于糖皮質激素的過量使用，造成了股骨頭周圍微環境中調控血管生成的活性細胞因子水平異常，股骨頭部位的血管生成過程受阻，影響了股骨頭周圍供血不良和微循環降低，缺氧缺血的環境導致骨細胞動態平衡破壞，最終引起股骨頭壞死[9]。

中醫學一般將股骨頭壞死歸類于“骨痹”“骨蝕”等范疇，主要是由于腎陽衰微，無以濡養筋骨，骨枯髓消導致的股骨頭病理改變。本研究采用的臨床驗方“活血生骨湯”具有補腎活血、生骨祛瘀的功效，臨床用藥基于中醫辨證論治充分考量患者個性病情加減化裁，取得了良好的治療效果。由于中藥成分過于復雜且難以完成定量定性的相關研究，中藥復方對于相應疾病治療過程的作用機制并不十分明確。本研究基于網絡藥理學、生物信息學與分子對接的技術，進一步分析了中藥復方活血生骨湯治療SONFH 的活性成分、潛在作用靶點與作用通路及其分子作用機制。

本研究結果顯示，活血生骨湯通過白樺脂醇、丹參素和18β-甘草次酸等多種潛在化學成分，可能作用于MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2 等蛋白靶點調控氧化應激反應、細胞的分化與遷移、細胞對激素的刺激反應、藥物代謝、免疫系統的正向調節和MAPK 級聯等生物學進程，影響催產素信號通路、VEGF 信號通路、Notch 信號通路、破骨細胞分化等多條通路調控共同發揮治療SONFH 的藥理作用。

根據BATMAN 數據庫獲取的成分靶點關系篩選結果，關鍵靶點與白樺脂醇、丹參素、18β-甘草次酸和去氫丹參新酮等成分關聯度較高。白樺脂醇廣泛存在于中藥植物類藥物中，具有降脂、抗炎、抗心肌缺血等多種藥理作用[10-11]。白樺脂醇可以明顯抑制血管中的IL-6、TNF-α 等炎癥因子表達從而改善高脂血癥模型小鼠動脈血管的病理學改變[12]，該過程或與改善脂代謝與血管內皮功能失衡及抑制IKKβ/NF-κB 信號通路減少癥反應的級聯放大有關。丹參素是中藥丹參的主要水溶性成分，藥物動力學研究已得到證明[13-16]。其保護心肌細胞、抗炎、抗血栓形成等作用已得到了廣泛的臨床應用。補腎活血湯的多種成分均具有血管新生、抗炎、抗血栓形成和骨組織代謝等作用，其或通過這些成分發揮對于SONFH 的治療作用。

PPI 蛋白互作網絡顯示，MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2 等在網絡中度值較高且明顯差異表達，是該網絡中的關鍵靶點。MAPK1 作為MAP 激酶信號傳導的重要組成部分，參與到MAPK/ERK級聯中介導轉錄、翻譯、細胞骨架形成等多種生物學功能。NOTCH1 存在著對骨吸收的抑制作用，而NOTCH2 在介導破骨細胞生成與骨吸收作用方面發揮作用[17-18]。NOTCH1 在成骨細胞中的激活會導致骨形成過程受損。與NOTCH1 作用相反，NOTCH2 通過誘導成骨細胞核因子激活加速骨細胞生成。PTGS2 在炎癥反應中具有特殊作用，PTSG1 與PTGS2 是諸多非甾體抗炎藥物的靶標[19-21]。LRRK2 與帕金森病具有非常密切的關系[22]，其病理性突變可增加激酶活性，從而加速細胞的死亡過程。

GO 生物學功能分析結果反映了治療過程與氧化應激反應、細胞的分化與遷移、細胞對激素的刺激反應、免疫系統的正向調節和MAPK 級聯等生物學進程具有較高的相關性。KEGG 信號通路富集分析結果中，催產素信號通路、VEGF 信號通路、Notch 信號通路、破骨細胞分化、鈣信號通路等信號通路在活血生骨湯SONFH 的治療過程中明顯富集。VEGF 是VEGF 信號通路中的關鍵因子，在調控血管通透性與調節血管內皮細胞代謝等方面具有重要作用，其作為促血管形成細胞因子，在骨組織分化、骨基質形成與細胞因子的發生發展存在密切聯系[23]。Notch 信號通路在哺乳動物組織的發育和維持中起到了傳遞相關信息的作用。在骨組織中，成骨細胞與破骨細胞的分化與正常功能表達都需要Notch 信號通路參與[24]。在骨組織的發育過程中，細胞在體內受到多個信號通路的共同作用，如Notch 信號通路與Wnt 信號通路在骨細胞中存在關聯機制，Wnt 信號通過誘導Notch 信號，在調節骨細胞分化與內穩態的調節方面發揮了重要的相互作用。還有研究表明，在前體脂肪細胞分化與骨髓間充質干細胞分化過程中，Notch 信號通路也發揮了重要作用[25]。Notch 信號通路對骨量動態平衡的維持過程呈雙向調節。因此，深入研究Notch 信號通路在骨代謝方面的具體作用機制，對于SONFH 發病機制的探索和新的治療思路的提出具有重要意義。破骨細胞分化主要受到RANKL 和免疫受體激活的信號通路調節，有研究表明，破骨細胞與免疫系統中的大多數細胞相互作用，在某些自身免疫性疾病中，T 細胞與破骨細胞均可被異常激活[26-27]。

分子對接結果顯示，關鍵靶點與其反向尋找的化學有效成分的對接結合能量均<-5 kCal/mol，這表示潛在活性藥物小分子與靶點蛋白的結合活性較好。

結合本研究結果，獲得了活血生骨湯治療SONFH 的潛在有效成分和關鍵靶點。根據GO 生物學功能富集分析與KEGG 信號通路富集分析結果，進一步討論了活血生骨湯治療SONFH 可能存在的多種生物學進程與相關的信號通路。并通過分子對接技術驗證了潛在活性成分與SONFH 關鍵靶點的結合效果，明確了SONFH 治療過程可能的作用機制。綜上，研究基于生物信息學與網絡藥理學的方法，對活血生骨湯組方治療SONFH 的作用機制進行了探索，但仍需后續實驗進一步觀察研究特定靶點與單體成分在病理過程中的作用。