PD-1基因單核苷酸多態性與肝細胞癌臨床表型的相關性研究

陸小華 袁洪新▲ 蘇靚靚

1.南通大學附屬醫院介入放射科，江蘇南通 226001；2.南通大學附屬醫院醫學影像科，江蘇南通 226001

肝細胞癌是臨床常見惡性腫瘤，其病死率高居我國惡性腫瘤第二位。肝細胞癌的形成和進展是由不同因素相互作用、多基因協同參與、多靶點多通路共同調控的復雜過程[1]。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是在基因組水平由單個核苷酸變異所引起的DNA 序列多態性。自發現至今，其已不僅作為預判疾病罹患風險的重要依據，還有望成為預估療效及預后的生物標志物[2]。目前其與肝細胞癌形成及轉歸存在關聯的報道較多[3-5]。對于腫瘤微環境的研究目前已成為熱點。免疫抑制機制在腫瘤形成發展的過程中占據主導地位，免疫T 細胞的耗竭是其中最重要的因素。研究表明，腫瘤T 細胞耗竭的重要標志包括程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）在內的多種負性共刺激分子高表達，在T 細胞免疫反應的負調節過程中發揮重要作用[6]。通過開展體內外基礎及臨床研究，開發相關藥物，阻斷這些分子的信號傳導通路，降低它們的表達水平，恢復T 細胞作為免疫屏障抵抗腫瘤的功能。其中，PD-1 是目前研究的熱門靶點，針對其設計的多種免疫藥物已應用于臨床[7-9]。

已有多種惡性腫瘤易感性與PD-1 基因SNP存在關聯的報道[10-11]，但其與肝細胞癌臨床表型相關的報道不多。本研究選取PD-1 基因中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）>5%，文獻中較多涉及且可經外周血標本進行基因分型的rs10204525 位點、rs2227982 位點、rs36084323 位點作為研究對象[12-13]，探究該基因SNP 與肝細胞癌臨床表型之間是否存在關聯性，以期為肝細胞癌個體化治療及預后判斷提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1—12月南通大學附屬醫院介入放射科收治的新發肝細胞癌患者165 例，入組后進行臨床相關資料收集及外周靜脈血標本采集。納入標準：①首診初治的肝細胞癌患者；②體力狀況評分（PS）<3 分患者。排除標準：①非首診初治肝細胞癌患者；②體力狀況評分（PS）≥3 分患者。其中男120 例（72.73%），女45 例（27.27%）；年齡25～90 歲，平均（62.20±1.24）歲；BCLC A 期17 例（10.3%），B 期90 例（54.55%），C 期58 例（35.15%）；有門靜脈侵犯31 例（18.79%），無門靜脈侵犯134 例（81.21%）；有肝外轉移39 例（23.64%），無肝外轉移126 例（76.36%）。診斷標準參考《原發性肝癌診療指南（2022年版）》[14]，156 例滿足臨床診斷標準，另有9 例經穿刺活檢滿足病理診斷標準。依據BCLC 分期標準加以分期。醫院醫學倫理委員會對本研究資料收集和血標本采集批準認可。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 混勻型干式恒溫器（TND03-H-H，Thermo Fisher 公司）；臺式離心機（Pico-21，Thermo Fisher 公司）；DNA 快速抽提試劑盒（上海生工公司）；漩渦混合器（GL-88B，其林貝爾儀器制造有限公司）；電泳槽（DYCZ-21，北京市六一儀器廠）；Synergy LX MULTI-Mode Microplate Reader（BioTek 公司）；HiSeq XTen 測序儀（Illumina 公司）。

1.2.2 位點分型 ①DNA 抽提：使用DNA 快速抽提試劑盒提取基因組DNA，凍存備用；②位點分型：利用包括cutadapt 軟件、prinseq-lite 軟件、bwa軟件、annovar 軟件等在內的panel 高通量數據分析技術進行相關位點基因分型。

1.3 統計學方法

本研究數據采用SPSS 22.0 統計學軟件進行統計分析。計數資料用[n（%）] 表示，采用χ2檢驗比較各位點突變基因型與野生基因型在不同臨床表型中的頻數分布差異，各位點突變基因型與野生基因型在肝細胞癌不同臨床表型之間的關聯強度采用比值比（odds ratio，OR）及其95% 置信區間（confidence interval，CI）的形式表示，并對P值、OR值從性別、年齡等方面進行校正。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rs36084323 SNP與肝細胞癌臨床表型的相關性分析

以該位點野生基因型CC 患者作為對照，雜合突變基因型CT 的患者分期偏晚的風險降低（OR=0.306，95%CI：0.118～0.679，P< 0.05）；出現門靜脈侵犯的風險降低（OR=0.239，95%CI：0.098～0.631，P< 0.05）；發生肝外轉移的風險降低（OR=0.394，95%CI：0.165～0.833，P< 0.05）。純合突變基因型TT 患者與野生型CC 患者相比，在肝細胞癌BCLC 分期、門靜脈侵犯、肝外轉移等臨床表型之間比較，差異無統計學意義（P> 0.05）。見表1。

表1 rs36084323 SNP與肝細胞癌臨床表型的相關性分析

2.2 rs10204525 SNP與肝細胞癌臨床表型的相關性分析

以該位點野生基因型CC 患者作為對照，攜帶雜合突變基因型CT、純合突變基因型TT 患者分別與野生基因型相比，在BCLC 分期、門靜脈侵犯、肝外轉移方面比較，差異無統計學意義（P> 0.05）。見表2。

2.3 rs2227982 SNP與肝細胞癌臨床表型的相關性分析

以該位點野生基因型GG 患者作為對照，攜帶雜合突變基因型AG、純合突變基因型AA 患者分別與野生基因型相比，在BCLC 分期、門靜脈侵犯、肝外轉移方面比較，差異無統計學意義（P> 0.05）。見表3。

3 討論

PD-1 屬于CD28 家族成員，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，基因定位2q37.35，其在T 細胞、B 細胞、NK細胞、DC 細胞等多種細胞中表達。其可通過下調機體免疫系統的免疫應答功能及抑制T 細胞活動調控免疫系統，從而對自身耐受起促進作用。雖可預防機體免疫性疾病發生，但也阻礙免疫系統識別殺滅腫瘤細胞。程序性死亡配體-1（programmed deathligand-1，PD-L1）作為PD-1 的配體，多于腫瘤細胞表面存在。腫瘤細胞表面PD-L1 的胞外區與免疫T 細胞表面高表達的PD-1 相結合，通過PD-L1/PD1 通路抑制免疫T 細胞增殖，進一步抑制抗腫瘤免疫應答。另外，研究發現在腫瘤浸潤性T細胞（tumor infiltratinglymphocyte，TIL）中PD-1 處于高表達水平。持續存活的腫瘤細胞可抑制PD-1在TIL 中的活化，使腫瘤細胞得以逃避免疫監視，同時能夠增強TIL 分泌免疫抑制類炎癥細胞因子，對腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、遷移等生物學行為起促進作用。目前針對PD-1 研發的藥物已廣泛應用于腫瘤臨床治療中，明顯改善部分患者的生存期[15-16]。

目前針對PD-1 基因SNP 的研究主要集中在腫瘤的遺傳易感性方面，而臨床工作中制訂治療方案時需考慮不同的臨床表型。對肝細胞癌臨床表型與該基因SNP 的相關性研究，可為肝細胞癌個體化治療以及預后判斷提供參考，現實價值和應用前景均較高。

本研究分析探討了PD-1 基因rs10204525、rs2227982、rs36084323 位點SNP 與肝細胞癌臨床表型之間的相關性。結果顯示，rs36084323 位點CT 基因型患者較野生基因型CC 患者BCLC 分期偏早、門脈侵犯/肝外轉移的風險顯著減少（P< 0.05），提示攜帶該基因型的肝細胞癌患者發生腫瘤侵襲轉移的可能性相對較小，預后可能更好。rs10204525、rs2227982 位點SNP 與相關臨床表型之間無相關性（P> 0.05）。通過檢測PD-1 基因rs36084323 位點的不同基因型，可預判肝細胞癌的臨床表型，為個體化治療及判斷預后提供參照。本研究雖取得陽性結果，但非大樣本研究，且受到多種混雜因素的影響，選擇偏倚不可避免。另外，僅對關聯性表象進行分析，尚未進一步深入探究其中機制。在今后的臨床及科研工作中，將簡化檢測流程，擴大樣本量，進一步研究相關機制，并設法減少干擾因素，以期取得質量更高、說服力更強的研究成果。

綜上所述，PD-1 基因SNP 與肝細胞癌臨床表型之間存在一定的相關性，檢測相關位點基因型對個體化治療及判斷預后具有一定的參考價值。