基于網絡藥理學探究“CRPC治療方”治療CRPC的作用機制

李愛玉 張志明 宋忠陽 朱 鵬 徐 倩 李高勤

1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中醫院腫瘤科，甘肅蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學附屬醫院腫瘤科，甘肅蘭州 730000；4.甘肅中醫藥大學附屬醫院急診科，甘肅蘭州 730000

根據2019年美國癌癥協會的最新數據顯示，前列腺癌高居美國男性新發癌癥的第1 位，其病死率居于第2 位[1]。在我國男性惡性腫瘤發病率中居于第6 位，病死率居于第9 位[2]。晚期前列腺癌患者通常采用內分泌療法治療，但經過中位時間18～24 個月后，大多數患者特異性標志物前列腺特異性抗原（PSA）再度升高，提示腫瘤細胞產生了耐藥性，臨床稱為去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）[3]。常規治療無效后，患者通常面臨著生存周期縮短，生活質量下降等問題，近年來，中醫藥在CRPC 患者生存周期以及生活質量等方面取得了較大的進展。

1 資料與方法

1.1 數據來源、錄入及規范

電子計算機檢索CNKI、萬方、維普以及CBM數據庫中收錄的已公開發表的中醫藥治療CRPC 的個人醫案。檢索時間從2000年1月1日至2021年10月31日，篩選后共納入29 篇文獻，36 個中藥處方，將其錄入表格進行統計，得出中藥113 味，后參照《中華人民共和國藥典》[4]以及《中藥大辭典》[5]對藥物名稱進行規范化處理。

1.2 納入及排除標準

納入標準：①文章中提出西醫診斷為CRPC；②文獻中醫案處方、藥物組成明確，并有明確臨床療效者。排除標準：①診斷不明確或錯誤的醫案；②醫案中就診次數過多且藥物變化描述及療效不明確者。

1.3 數據處理

將處方錄入Microsoft Office Excel 2017 統計表格中，經過中藥規范化處理后，通過矩陣分析等統計藥物頻次。

1.4 關鍵中藥治療CRPC可能機制探討

利用TCMSP 數據庫，將OB、DL 分別設置為≥0.3、≥0.18[6]，以此為篩選條件獲取中藥活性成分，再次將活性成分的Smiles 結構序列導入Swiss TargetPrediction 數據庫預測靶點，以置信度閾值評估預測結果的可靠性。在GeneCards 數據庫、OMIM數據庫中以“castration-resistant prostate cancer”為關鍵詞檢索收集疾病相關靶點；并利用Venny 2.1.0得到潛在靶點。將潛在靶點上傳至String 數據庫構建PPI 網絡；并利用Cytoscape 3.8.2 的CytoNCA 插件篩選關鍵靶點。最后應用Metascape 進行GO 富集分析與KEGG 通路分析，最后利用R 語言對結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 中醫藥治療CRPC的中醫藥統計

通過矩陣分析等統計藥物頻次，前十位分別為黃芪、熟地黃、茯苓、姜黃、白術、補骨脂、黨參、炙甘草、白花蛇舌草、莪術，取以上藥物組成“CRPC 治療方”。

2.2 “CRPC治療方”中藥物活性成分及治療CRPC的作用靶點

在TCMSP 中篩選后共得到174 個活性成分，其中黃芪20 個、熟地黃2 個、茯苓15 個、姜黃3 個、白術7 個、補骨脂4 個、黨參21 個、甘草92 個、白花蛇舌草7 個、莪術3 個，去除重復值共得到157 個活性成分，后通過PubChem 收集藥物活性成分的Smiles 結構序列。

將收集到的Smiles 結構序列導入至Swiss TargetPrediction 數據庫中預測靶點，去除重復值后共得到136 個作用靶點。利用GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫篩選CRPC 靶點，整理并去除重復值后，共獲得1396 個靶點。通過Venny 2.1.0 取藥物靶點與疾病靶點交集，共得到99 個“CRPC 治療方”治療CRPC 的潛在作用靶點。見圖1。

2.3 篩選“CRPC治療方”治療CRPC的核心靶點

通過String 數據庫和Cytoscape 3.8.2 軟件，構建“活性成分-基因靶點”網絡圖，見圖2，根據Degree 值排序可知核心化學成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、甘草查爾酮A、芒柄花黃素等；根據表示靶點之間相關性的Degree 值排序可知核心靶點為STAT3、c-jun、TP53、HIF1A、ESR1 等。

將疾病與處方的交集基因導入至Cytoscape 3.8.2 的CytoNCA 插件中，網絡共有91 個節點，716條邊，節點的平均Degree 值為15.7。根據BC、CC、DC、EC、LAC 及NC 的中位值進行兩次過濾后，可得出“CRPC 治療方”治療CRPC 的核心靶點，見圖3。

2.4 GO富集分析

在Metascape 數據庫中導入99 個疾病藥物交集靶點并進行GO 富集分析。分析結果顯示，共包括1777 個生物過程、40 個細胞組分以及153 個分子功能。根據P值大小進行排序，選擇前10 個結果繪制柱狀圖，見圖4。由圖可知，GO 富集分析結果主要涉及應答氧化應激、細胞對化學應激的反應、細胞對氧化應激的反應等生物過程以及膜區、膜微區、膜筏等細胞組分，泛素-如蛋白質連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合、蛋白質異二聚活性等分子功能。

2.5 KEGG通路分析

將99 個疾病藥物交集靶點導入Metascape 數據庫進行KEGG 通路分析，結果顯示與PI3K-Akt信號通路、人巨細胞病毒感染、前列腺癌等148 條信號通路有關，并根據通路富集基因的個數排序，取前30 條通路繪制柱狀圖，見圖5。由圖可知，基因富集數目最多、最顯著的通路是PI3K-Akt 信號通路。并對PI3K-Akt 信號通路進行可視化分析，見圖6，由圖可知，“CRPC 治療方”通過多個上下游蛋白調控PI3K-Akt 信號通路。

3 討論

前列腺癌癌細胞對雄激素途徑有高度敏感性，通過激素調控和去勢可導致癌細胞死亡，目前CRPC 臨床仍常用雄激素剝奪治療聯合糖皮質激素進行治療，但常出現耐藥的問題[6]。因此，尋找一種療效佳、安全且復發率低的治療手段具有重要的臨床意義。研究發現，苦參堿、姜黃素、人參皂苷等中藥單體可通過相關靶點直達疾病要點[7]，使中醫藥治療CRPC 取得更進一步的發展，也為CRPC 的治療提供新的思路及方向。

本研究通過整理近年公開發表的治療CRPC的中醫處方后發現，用藥頻率前十位的中藥分別是黃芪、熟地黃、茯苓、姜黃、白術、補骨脂、黨參、炙甘草、白花蛇舌草、莪術；此組方中黃芪、黨參、炙甘草益氣扶正，茯苓、白術健脾運脾，熟地黃、補骨脂補腎填精，姜黃、莪術行氣活血，白花蛇舌草兼清里熱。CRPC 的中醫病機可概括為本虛標實、脾腎兩虛，兼有濕、痰、瘀、毒，綜合分析，上述處方治法可總結為“補腎健脾、益氣活血、兼清里熱”，符合上述病機。遂后期加以網絡藥理學分析以期揭示其潛在治療靶點及機制。

分析“活性成分-基因靶點”圖，Degree 值排名前三的中藥活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚；以上三種均為黃酮類化合物，具有多種生物活性、廣泛的藥理作用。經研究發現，單用槲皮素、木犀草素、山奈酚或與化療藥物聯合使用表現出抑癌性，其抗癌作用在前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等幾種癌癥中已經顯現[8]，對于前列腺癌的抗癌作用可總結如下：①抑制癌細胞增殖及促進凋亡；②抑制癌細胞的侵襲與遷移；③抑制腫瘤血管新生及增加抗癌藥物的敏感性；④逆轉耐藥性；⑤誘導細胞周期阻滯等[9-13]。這與本研究結果相符。

GO 富集分析主要涉及在細胞對化學應激的反應、應答氧化應激、細胞對氧化應激的反應等生物過程，膜筏、膜微區、膜區等細胞組分，泛素-如蛋白質連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合、蛋白質異二聚活性等分子功能。KEGG 富集分析主要涉及PI3K-Akt 信號通路、人巨細胞病毒感染、前列腺癌等通路，其中PI3K-Akt 信號通路富集數目最多，提示該信號通路可能與“CRPC 治療方”的治療作用密切相關。CRPC 細胞可表達出大量活化的PI3K和Akt，對癌細胞的增殖、代謝及凋亡起到一定的調節作用，且會影響細胞周期，對CRPC 的發展起到十分重要的作用[14]。除此之外，也有學者發現Akt 的激活程度會顯著影響預后，且呈正相關[15]。本研究KEGG 通路分析亦提示與人巨細胞病毒感染、前列腺癌等通路密切相關，以上通路亦與CRPC 的發病密切相關，本研究提示，以上分析提示“CRPC 治療方”的作用機制與多個靶點、多條通路相關，“CRPC治療方”治療CRPC 可能通過PI3K-Akt 通路等多條信號通路發揮抗癌等治療作用。

綜上所述，本研究通過處方統計及網絡藥理學分析探討了“CRPC 治療方”治療CRPC 的潛在作用機制，發現“CRPC 治療方”可能通過槲皮素、木犀草素、山奈酚等多種活性成分，作用在STAT3、c-jun、TP53、HIF1A、ESR1 等多個疾病靶點，調控PI3K-Akt 信號通路、人巨細胞病毒感染、前列腺癌等通路調節癌細胞的增殖、代謝及凋亡，進而延緩CRPC 的疾病進程，改善患者生活質量。

綜上所述，本研究發現“CRPC 治療方”通過多成分、多靶點、多通路治療CRPC，這為后續進一步深入研究CRPC 的治療方法奠定了一定的基礎。