微絲解聚因子（cofilin）對膠質瘤遷移和浸潤的影響

呂士紅 王長杰 朱洪春 楊白婧

牡丹江醫學院附屬第二醫院消化內科，黑龍江牡丹江 157000

膠質細胞包括星形膠質細胞、無突膠質細胞、少突膠質細胞，對神經元有支持和引導遷移的作用，在神經系統的修復中發揮重要的作用，參與髓鞘的形成，參與血腦屏障。發生在神經外胚層的膠質瘤是神經系統常見的腫瘤，起源于神經間質細胞，惡性膠質瘤的五年生存率低，平均生存期短[1]。延長患者的生存期，提高患者生活質量是科研和醫療工作者的急迫任務。細胞骨架的功能包括維持細胞形態、保持內部細胞結構有序性、基因表達、細胞分化，微絲是細胞骨架的主要成分之一[2]。微絲解聚因子（cofilin）是肌動蛋白結合蛋白，調節微絲骨架重建，影響其細胞增殖、遷移、凋亡等功能[3-4]。本研究分析cofilin 對膠質瘤遷移和浸潤的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

膠質母細胞瘤干細胞（GSC）株來自牡丹江醫學院實驗室，包括基因沉默GSC 細胞（對照組）與過表達cofilin 的GSC 細胞（觀察組）。細胞培養液（賽默飛），10%胎牛血清，細胞培養箱（博科集團），熒光顯微鏡（奧林巴斯）。Tracking Tool PRO v2.1 軟件，Transwell 實驗板。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 10% 胎牛血清，細胞培養液DMEM，37℃，5%CO2濃度的細胞培養箱內培養，每2～3 d 細胞傳代一次。

1.2.2 劃痕實驗[5]將所用的器械消毒滅菌。在6 孔板上使用記號筆過孔均勻劃線，間隔1 cm。在6 孔板中接種對數生長期細胞，待細胞完全生長融合，再進行劃痕實驗。用移液器洗頭垂直劃線用力均勻勻速劃痕，用PBS 液洗滌。將細胞在培養基中培養48 h，分別于0、12 以及48 h，用顯微鏡拍攝細胞圖片。用Image J 軟件測量細胞的測量距離。遷移速率=（0 時的傷口寬度-觀察時點的傷口寬度）/0 h 時傷口寬度×100%，評價cofilin 對膠質瘤細胞遷移的影響。

1.2.3 浸潤實驗[5]制備Transwell 小室，下室加入含10%胎牛血清的培養液600 μl。取對數生長的細胞0.25%的胰蛋白酶消化，PBS 清洗3 次，用細胞培養液（無血清）制備細胞懸液，調整濃度為1×105/ml。Transwell 板做好標記，取300 μl 細胞懸液加入Transwell 板的上室，移入37℃培養箱培養24 h。取出Transwell 小室，刮出未浸潤細胞，甲醛固定，晾干，吉姆薩液避光染色，PBS 液洗滌3 次。晾干，顯微鏡下隨機觀察5 個視野，計數穿越小室膜的細胞數量，評價cofilin 對膠質瘤細胞浸潤的影響。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據。計量資料用均數±標準差（）表示，行t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組膠質瘤細胞遷移速率比較

24、48 h 觀察組膠質瘤細胞遷移速率顯著高于對照組，差異有統計學意義（P< 0.05）。見表1。

表1 兩組膠質瘤細胞遷移速率比較（%，±s）

組別n24 h48 ht 值P 值觀察組 633.32±5.6168.95±4.3312.3150.000對照組 613.18±2.1625.22±3.477.2150.000 t 值8.20619.304 P 值0.0000.000

2.2 兩組膠質瘤細胞浸潤個數比較

觀察組觀察到的膠質瘤細胞浸潤個數[（196.33±38.43）個]顯著高于對照組[（83.26±25.52）個]，差異有統計學意義（t=5.481，P=0.001）。見圖1。

3 討論

膠質瘤占腦腫瘤的40%～50%，臨床常見。膠質瘤很難根治，術后往往容易復發，不同級別的膠質瘤預后各不相同，高級別膠質瘤患者病情進展較快，術后短時間內就可復發，生存時間也往往相對較短。對膠質瘤的治療主要是早發現、早治療，以改善預后。微絲與微管、中等纖維共同組成細胞質骨架。細胞質骨架具有彌散性、整體性、變動性，維持細胞形態，在細胞運動、能量轉換、物質運輸、細胞分裂、信息傳遞、基因表達、細胞分化等過程中發揮重要的作用。真核細胞中的微絲由肌動蛋白組成，直徑7 nm，程度不一，實心細絲狀骨架纖維。微絲具有支架功能，肌肉收縮功能，細胞定向運動、保質環流、細胞內吞、外涂，細胞分裂，細胞分化，微絨毛收縮，信息傳遞等作用[6-8]。cofilin 蛋白通過磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇、pH 改變等進行調節細胞內結合和解聚F 肌動蛋白，介導細胞內信號途徑，從而調節肌動蛋白骨架的重組[9-11]。在神經細胞中，細胞骨架中的肌動蛋白在多種重要的生理活動中發揮作用，包括肌肉收縮，胞質，神經纖維再生，神經纖維退行性改變等。在這個過程中還需要一些調節肌動蛋白聚合和解聚的蛋白參與。在一定條件下，cofilin 蛋白可使肌動蛋白微絲解聚，從而影響細胞骨架蛋白動力學。從基因上，cofilin 基因主要有cofilin-1 和cofilin-2，表達相應的蛋白質。cofilin-1 主要表達在非肌肉組織，尤其以腦組織為主。而cofilin-2 主要表達在肌肉組織中，例如骨骼肌、心肌等。cofilin-1 參與神經元的分化。在神經細胞中，微絲的解聚與重塑影響神經元的極化以及樹突和軸突的形成，cofilin-1 通過解聚微絲參與神經元的分化過程。cofilin-1 調節細胞骨架的變化，影響神經元的定向運動，進而影響神經系統的正常發育以及損傷后的修復過程。cofilin 蛋白還參與調節神經突觸的可塑性[12]。

研究顯示，食管癌組織cofilin-1 陽性高表達與臨床分期晚、淋巴結轉移、預后差有關[13]。王靜等[14]的研究結果也顯示，cofilin-1 的表達水平與慢性粒細胞白血病患者的不良生存預后有關。cofilin-1 與胃腸道間質瘤浸潤的深度、腫瘤的直徑、病理性核分裂象正相關[15]。本研究結果與既往研究結果相似，過表達cofilin 的GSC 單核細胞遷移速率要顯著高于基因沉默的細胞，發生浸潤的細胞個數也顯著多于基因沉默的細胞（P< 0.05）。cofilin 通過誘導片狀偽足的形成，進而影響細胞運動的方向。cofilin參與信號轉導從而參與細胞運動及形態的改變，在腫瘤細胞的轉移、浸潤過程中發揮重要的作用[16-17]。本研究未對cofilin 影響膠質瘤細胞的遷移和浸潤的具體機制進行研究，期待在今后的研究中進一步分析。

綜上所述，cofilin 可促進膠質瘤細胞的遷移與浸潤，可能與cofilin 參與膠紙瘤細胞運動、信息傳遞、細胞分裂、基因表達等有關，期待在今后的研究中能夠對具體機制進行進一步分析。