基于網絡藥理學和ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型探究血府逐瘀湯治療冠心病的核心作用靶點及機制研究

馬淑慧，董靜，王少蘭，李敏杰，王海芳，趙學飛

目前，心血管疾病是我國城鄉居民的首位死亡原因。《中國心血管健康與疾病報告2020》估測，我國冠心病現患人數約1 139萬例，其發病率及死亡率均呈逐年上升趨勢［1］。冠心病的危險因素包括高脂血癥、高血壓、糖尿病和吸煙等，其中血脂代謝異常是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要原因，斑塊破裂是引起冠心病患者死亡的主要原因，且常規抗血小板治療、降脂治療及支架置入并未使冠心病患者心血管不良事件發生率和死亡率明顯降低。

動脈粥樣硬化的中醫病機不外虛實兩端，以實證居多，氣滯、血瘀、痰飲、寒凝等阻痹胸中，致經脈閉阻、氣血運行不暢而發病，故在治療過程中多以行氣、活血、化瘀、通絡為法。血府逐瘀湯是由王清任在《醫林改錯》中提出，主治胸中血瘀證，其活血祛瘀、理氣止痛之功效能有效緩解氣滯血瘀所致的胸痹癥狀［2］。臨床研究表明，血府逐瘀湯化裁治療在改善患者局部微循環、增加心肌供血、減輕心絞痛癥狀及降低血脂等方面具有良好效果［3-5］。但血府逐瘀湯具有復雜的藥物活性成分，可多層次、多途徑、多靶點發揮作用，而網絡藥理學可以從系統層次解釋復雜藥物治療疾病的機制，但這種方法僅具有理論價值，尚缺乏實證研究。本研究基于網絡藥理學探索血府逐瘀湯治療冠心病的潛在核心作用靶點，然后制備ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型進行驗證，以期為血府逐瘀湯治療冠心病的機制研究提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 血府逐瘀湯藥物活性成分及作用靶點篩選 血府逐瘀湯由桃仁、紅花、川芎、赤芍、當歸、牛膝、柴胡、桔梗、枳殼、地黃、甘草11味中藥組成。在TCMSP數據庫篩選血府逐瘀湯的藥物活性成分，篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18；并在2015版《中國藥典》中查詢血府逐瘀湯11味中藥必須含有的藥物活性成分進行補充。結合上述藥物活性成分并通過FAFDrugs4數據庫篩選血府逐瘀湯的藥物活性成分，之后通過化合物靶標數據庫Swiss TargetPrediction、SEA和Drugbank分別查詢各藥物活性成分的靶點，合并藥物活性成分靶點并去重，之后使用UniProt數據庫的official gene symbol統一命名。

1.2 冠心病致病靶點篩選 以“coronary heart disease”和“coronary atherosclerotic heart disease”為檢索詞，在Drugbank、GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD等疾病數據庫中查找冠心病致病靶點，選取可能性＞0.1的致病靶點，合并致病靶點并去重，之后使用UniProt數據庫的official gene symbol統一命名。

1.3 交集靶點篩選及成分-靶點網絡構建 使用在線網站Jvenn（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），輸入血府逐瘀湯藥物活性成分靶點和冠心病致病靶點，獲得藥物-疾病交集靶點。使用Cytoscape（Version 3.9.0），將交集靶點導入Cytoscapebing以構建成分-靶點網絡，計算度值（Degree），并根據度值大小定義各節點高度以反映節點的重要性。

1.4 核心靶點分析 將藥物-疾病交集靶點上傳至STRING數據庫，構建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡，置信度選擇中等（0.75），隱藏無連接靶點，然后下載PPI網絡文件。使用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件（用于PPI網絡中的核心靶點）計算各靶點度值、最大基團中心性（maximal clique centrality，MCC）、最大鄰域分量（maximum neighborhood component，MNC）和邊過濾成分（edge percolated component，EPC）評分，提取同時滿足上述算法的前10個靶點并在Jvenn在線網站進行交集處理，得到PPI網絡中的核心靶點。

1.5 GO功能、KEGG通路富集分析 獲得藥物-疾病交集靶點后，使用在線網站OmicShare（https://www.omicshare.com/tools/）進行GO功能和KEGG通路富集分析，根據基因富集率和q值（校正后的P值）展示GO功能富集分析中生物學過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）共同排序前5位的結果條目及KEGG通路富集分析中信號通路排序前5位的信號通路。

1.6 制備ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型 5～6周齡雄性C57BL/6小鼠7只和ApoE-/-小鼠30只均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔實驗動物生產許可證：SCXK（京）2021-0006〕，體質量16～20 g，飼養于SPF級環境中的獨立通氣籠( individually ventilated cages，IVC），自由飲水飲食，12 h光照/黑暗循環，環境溫度維持在25 ℃左右。適應性飼養1周。小鼠分組如下：（1）低脂對照組：C57BL/6小鼠7只，進食低脂飼料；（2）高脂模型組：ApoE-/-小鼠10只，進食高脂飼料；（3）低劑量灌胃組：ApoE-/-小鼠10只，進食高脂飼料，然后每10 g鼠重給予0.1 ml血府逐瘀湯藥液（1 g/ml）灌胃，每日固定時間灌胃1次；（4）高劑量灌胃組：ApoE-/-小鼠10只，進食高脂飼料，然后每10 g鼠重給予0.1 ml血府逐瘀湯藥液（2 g/ml）灌胃，每日固定時間灌胃1次。高脂/低脂飼料均購自南通特洛菲飼料科技有限公司。飼養周期為3個月，之后使用異氟烷麻醉小鼠，眼球取血后處死小鼠，并摘取胸腹主動脈樣本。所有小鼠飼養方法和操作方法符合陜西中醫藥大學實驗動物福利與倫理相關規定。

1.7 血府逐瘀湯藥液制備 桃仁12 g，紅花、當歸、生地黃、牛膝各9 g，川芎、桔梗各4.5 g，赤芍、枳殼、甘草各6 g，柴胡3 g，均購自陜西中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科。每劑中藥使用2 L水煎至300 ml，然后使用寧波新芝冷凍干燥機（SCIENTZ-10N）收集湯劑的干燥粉末，冷藏于-80 ℃超低溫冰箱。使用滅菌用水將干燥粉末調配為1 g/ml和2 g/ml的藥液。

1.8 全自動生化分析儀檢測小鼠血清血脂指標 獲得小鼠血液后，室溫靜置30 min，3 000 r/min（離心半徑4.5 cm）離心10 min，獲取上層血清，使用日立7180全自動生化分析儀檢測血清LDL、HDL、TC、TG。

1.9 HE染色和Masson三色染色 采用多聚甲醛固定小鼠胸腹主動脈樣本，常規石蠟包埋、切片、脫蠟、復水，分別進行HE染色和Masson三色染色，嚴格按照HE染色試劑盒（G1120，Solarbio）和Masson三色染色試劑盒（G1340，Solarbio）說明書進行操作。使用玻片掃描系統（Slideview VS200，Olympus）掃描組織樣本后，使用Image J分別計算膠原纖維面積/斑塊總面積、斑塊總面積/血管腔面積。

1.10 免疫組化染色 采用多聚甲醛固定小鼠胸腹主動脈樣本，常規石蠟包埋、切片，使用二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟，然后使用枸櫞酸進行抗原修復、3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物，之后使用3% BSA組織封閉1 h，使用缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）（1∶200，Abmart）和血管內皮生長因子2型受體（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）（1∶200，Abmart）孵育過夜，次日使用二抗（HRP標記）孵育1 h，然后使用DAB顯色，蘇木素復染細胞核，梯度乙醇溶液、正丁醇和二甲苯脫水，最后使用中性樹脂封固。使用玻片掃描影像系統（SQS-40P，深圳市生強科技有限公司）掃描組織，使用Image J計算陽性面積/斑塊總面積。

1.11 統計學方法 應用Graphpad Prism 9.0軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗；使用Graphpad Prism 9.0軟件繪制條形圖。以q或P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血府逐瘀湯藥物活性成分及作用靶點 在TCMSP數據庫中篩選出226個血府逐瘀湯的藥物活性成分，然后使用FAFDrugs4數據庫進行再次篩選，共89個藥物活性成分結果為“accepted”。此外，2015版《中國藥典》增補了13個有效藥物活性成分，共102個藥物活性成分進入后續研究。其中在Swiss TargetPrediction中發現473個作用靶點，在SEA中發現365個作用靶點，在Drugbank中發現191個作用靶點。將上述3個作用靶點合并去重，共獲得792個作用靶點。

2.2 冠心病致病靶點 在Drugbank中發現68個冠心病致病靶點，在GeneCards中發現1 844個冠心病致病靶點，在OMIM中發現144個冠心病致病靶點，在PharmGKB中發現115個冠心病致病靶點，在TTD中發現21個冠心病致病靶點。將上述5個疾病數據庫的冠心病致病靶點合并并去重，共獲得2 060個冠心病致病靶點。

2.3 血府逐瘀湯和冠心病的藥物-疾病交集靶點及成分-靶點網絡構建 共發現170個藥物-疾病交集靶點，使用Cytoscape軟件構建成分-靶點網絡，其中度值排序前5位的成分為槲皮素（102）、木犀草素（40）、山柰酚（37）、漢黃芩素（30）、柚皮素（28）；度值排序前5位的靶點為PTGS2（128）、ESR1（90）、HSP90AA1（87）、CALM1（84）、AR（82）。

2.4 核心靶點 將170個藥物-疾病交集靶點輸入STRING數據庫，獲得PPI網絡，共169個節點和3 133條邊。采用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件對169個節點進行計算，提取度值、MCC、MNC、EPC評分的前10個靶點并進行交集處理，共獲得6個核心靶點：IL6、TNFA、STAT3、EGFR、HIF1A和MMP9，見圖1。

圖1 PPI網絡中的核心靶點Figure 1 Core targets of the PPI network

2.5 GO功能、KEGG通路富集分析結果 對170個藥物-疾病交集靶點進行GO功能、KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結果顯示，排序前5位的結果條目為細胞遷移的正向調節（RR=9.87%）、細胞移動的正向調節（RR=9.64%）、細胞運動的正向調節（RR=9.38%）、細胞組分移動的正向調節（RR=9.35%）和循環系統過程（RR=7.82%）。根據q值進行排序，前3個條目為磷代謝過程的正向調控（q=7.43E-48）、細胞內信號轉導的正向調節（q=3.45E-47）和細胞運動的正向調節（q=5.60E-41）。

KEGG富集分析結果顯示，根據RR排序前5位的結果條目為HIF-1α信號通路（RR=23.97%）、腫瘤壞死因子信號通路（RR=19.30%）、血管內皮生長因子信號通路（RR=19.04%）、催乳素信號通路（RR=17.95%）和白介素17信號通路（RR=16.94%）；根據q值降序排列，HIF-1α信號通路位列第1。

2.6 血府逐瘀湯對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型血脂指標的影響 四組小鼠TG比較，差異無統計學意義（F=1.330，P=0.299）；四組小鼠LDL、HDL、TC比較，差異有統計學意義（F值分別為95.72、208.70、106.60，P值均＜0.001）；其中高脂模型組小鼠LDL、TC高于低脂對照組，HDL低于低脂對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠LDL、TC低于高脂模型組，HDL高于高脂模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 四組小鼠血脂指標比較Figure 2 Comparison of blood lipid indexes in the four groups of mice

2.7 血府逐瘀湯對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型主動脈粥樣硬化斑塊的影響 低脂對照組主動脈組織未見明顯著色，故未進行定量分析。高脂模型組、低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠主動脈組織膠原纖維面積/斑塊總面積、斑塊總面積/血管腔面積比較，差異有統計學意義（F值分別為53.00、32.00，P值均＜0.001）；低劑量灌胃組和高劑量灌胃組小鼠主動脈組織膠原纖維面積/斑塊總面積高于高脂模型組，斑塊總面積/血管腔面積低于高脂模型組，高劑量灌胃組小鼠主動脈組織膠原纖維面積/斑塊總面積高于低劑量灌胃組，斑塊總面積/血管腔面積低于低劑量灌胃組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3～6。

圖3 四組小鼠主動脈組織HE染色結果（比例尺=100 μm）Figure 3 HE staining results of abdominal aorta in the four groups of mice

圖4 高脂模型組、低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠主動脈組織膠原纖維面積/斑塊總面積比較Figure 4 Comparison of collagen fiber area/total plaque area of abdominal aorta in the high-fat model group, low-dose gavage group and high-dose gavage group

圖5 四組小鼠主動脈組織Masson三色染色結果（比例尺=100 μm）Figure 5 Masson trichrome staining results of abdominal aorta in the four groups of mice

圖6 四組小鼠主動脈組織斑塊總面積/血管腔面積比較Figure 6 Comparison of plaque area/lumen area of abdominal aorta in the four groups

2.8 血府逐瘀湯對HIF-1α、VEGFR2表達的影響 低脂對照組主動脈組織未見明顯著色，故未進行定量分析。免疫組化染色結果顯示，高脂模型組、低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠HIF-1α、VEGFR2陽性面積/斑塊總面積比較，差異有統計學意義（F值分別為33.00、27.00，P值均＜0.05）；低劑量灌胃組和高劑量灌胃組小鼠HIF-1α、VEGFR2陽性面積/斑塊總面積低于高脂模型組，高劑量灌胃組小鼠HIF-1α、VEGFR2陽性面積/斑塊總面積低于低劑量灌胃組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖7～8。

圖7 四組小鼠主動脈組織免疫組化染色結果Figure 7 Immunohistochemical staining results of abdominal aorta in the four groups of mice

圖8 高脂模型組、低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠主動脈組織HIF-1α、VEGFR2表達水平比較Figure 8 Comparison of expression levels of HIF-1α and VEGFR2 of abdominal aorta in the high-fat model group, low-dose gavage group and high-dose gavage group

3 討論

近年來雖然我國心血管疾病的防治已經取得長足進步，但冠心病患者人數仍呈快速上升趨勢，尤其是農村地區，冠心病死亡率明顯升高［6］。目前，常規抗血小板、降脂和擴血管等藥物治療并未有效阻止冠心病病情進展及減少急性事件的發生。近年來，采用中藥防治冠心病取得較大進展，如腦心通膠囊、通心絡膠囊和刺五加注射液等可以通過多種途徑減輕冠心病患者癥狀及改善其心功能［7］。但中藥治療冠心病的機制尚未明確，本研究基于網絡藥理學和動物實驗探索了血府逐瘀湯治療冠心病的作用靶點及機制。

血府逐瘀湯由多味中藥組成，其治療冠心病的藥理機制包括保護內皮功能、改善血液流變學、拮抗血小板聚集、抗炎、抗氧化應激等［8］。本研究通過查詢藥物數據庫，得到血府逐瘀湯11味中藥含有的102個藥物活性成分，并發現槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素可能在冠心病的治療中發揮了重要作用。槲皮素是一種類黃酮化合物，其在抑制粥樣硬化斑塊形成方面具有多種作用，如降低前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）水平、血脂［9］，緩解氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）引起的巨噬細胞自噬［10］，調節氧化應激，保護血管內皮細胞功能［11］等。木犀草素同為黃酮化合物，其被證明可以通過調節AKT和SRC而抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移［12］，并通過調節mRNA穩定性和NOX4/ROS-NF-κB通路而減輕炎癥和氧化損傷［13］。山柰酚是天然類黃酮，作為一種植物源性雌激素，其能激活G蛋白偶聯雌激素受體和下游的PI3K/AKT/Nrf2通路，進而抑制小鼠動脈粥樣硬化進展［14］；此外，山柰酚還可以通過炎癥依賴性途徑而減輕ox-LDL誘導的內皮細胞損傷［15］。漢黃芩素具有豐富的抗炎特性，可以通過作用于VEGFR2而抑制脂多糖誘導的血管生成［16］，而炎癥刺激的血管生成是粥樣硬化斑塊不穩定的重要因素［17］；同時，漢黃芩素還可以干擾DAG-PKC通路，改善高脂誘導的血管平滑肌細胞凋亡［18］，在一定程度上保護了晚期動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。柚皮素是一種柑橘類黃酮，具有強效降脂特性，有助于降低高脂血癥、提高胰島素敏感性［19］，故可以有效減輕低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）-/-小鼠動脈粥樣硬化并抑制其復雜病變的形成［20］。一項使用分子網絡建模和分析藥物基因組學的研究發現，血府逐瘀湯有667個藥物活性成分［21］，而本研究經過檢索和篩選得到血府逐瘀湯的102個藥物活性成分，數量上存在差異的原因可能是上述研究并未對667個藥物活性成分進行ADMETox（吸收、分布、代謝、排除和毒性）過濾，而經過FAFDrugs4數據庫的ADME-Tox規則篩選后的藥物活性成分具有更可靠的“可藥性”［22］。綜上，血府逐瘀湯包含的重要藥物活性成分可以從控制血脂、減輕氧化應激、抑制平滑肌細胞凋亡和保護內皮細胞等方面抑制或減緩動脈粥樣硬化的發生和發展。

本研究通過KEGG通路富集分析發現，HIF-1α在富集率和可信度上均顯著，其是篩選出的核心靶點之一。HIF-1α是缺氧反應中的重要分子，在缺氧狀態下，其蛋白質水平穩定，蛋白質進入細胞核與HIF-1β伴侶形成二聚化體。生成的HIF-1α/β復合物與靶基因啟動子區域中的特定缺氧反應元件結合，并調節靶基因的表達［23］。在動脈粥樣硬化發生發展中伴隨動脈血管逐漸狹窄，機體組織開始缺氧或缺血，這會誘導HIF-1α活性增加及血管生成因子生成，刺激血管重塑以增加側支血管血流量，并增加輸送至心肌代償性肥大部位的氧氣。此外，HIF-1α還是血管內皮細胞增殖和遷移的重要調控因子，敲除HIF-1α可導致血管內皮細胞凋亡，而適度增加HIF-1α可以緩解局部缺氧［24］。

本研究通過構建ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型發現，低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠膠原纖維面積/斑塊總面積高于高脂模型組，斑塊總面積/血管腔面積低于高脂模型組。一項納入6 333例冠狀動脈粥樣硬化患者的薈萃分析發現，斑塊體積百分比每減少1%，患者主要心血管不良事件發生風險降低約20%［25］。通常認為斑塊中膠原相對含量越高，提示斑塊越穩定。且既往研究表明，血府逐瘀湯可以減少金屬蛋白酶類表達，抑制斑塊內膠原降解，調節心肌梗死后心肌膠原代謝，從而改善心功能和減輕心室重構［26］。因此，通過本研究結果推斷血府逐瘀湯可能通過抑制斑塊中膠原纖維降解，進而維持斑塊纖維帽穩定，這從動物水平證實了血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化的治療作用。

雖然HIF-1α可能在心臟肥大期間發揮保護心肌、促血管生成作用，但其可能通過導致能量衰竭的代謝重編程而在心力衰竭終末期發揮致病作用［27］。更重要的是，斑塊形成和并發癥進展的主要風險因素是新的弱血管形成，因HIF-1α在動脈粥樣硬化斑塊核心內表達，可誘導VEGF和VEGRF2表達并產生脆弱的新生血管［17］。本研究GO功能富集分析發現，藥物-疾病交集靶點中與細胞運動和遷移條目顯著富集，因內皮細胞向缺血區域移動、遷移是促進新生血管形成的重要過程［28］。因此，本研究將后續的驗證重點聚焦在HIF-1α信號通路方面，結果顯示，低劑量灌胃組和高劑量灌胃組小鼠主動脈組織HIF-1α、VEGFR2陽性面積/斑塊總面積低于高脂模型組，高劑量灌胃組小鼠主動脈組織HIF-1α、VEGFR2陽性面積/斑塊總面積低于低劑量灌胃組。雖然本研究并未對斑塊內的新生血管進行檢測，但作為血管生成的主要調節因子，HIF-1α和VEGFR2變化足以說明血府逐瘀湯具有降低斑塊內新生血管生成的能力，而較少的新生血管可增加斑塊的穩定性［29］，因此認為血府逐瘀湯可通過穩定斑塊、延緩動脈粥樣硬化進展，避免斑塊破裂導致的急性事件發生。

既往研究報道，LDL每降低1 mmol/L，患者主要血管事件發生風險可降低21%［30］，且減少LDL沉積可以實現斑塊的逆轉［31］。本研究結果顯示，高脂模型組小鼠LDL、TC高于低脂對照組，HDL低于低脂對照組；低劑量灌胃組、高劑量灌胃組小鼠LDL、TC低于高脂模型組，HDL高于高脂模型組，提示血府逐瘀湯可有效改善冠狀動脈粥樣硬化小鼠的血脂指標，且這種改善作用與血府逐瘀湯劑量無明顯關系；但高劑量血府逐瘀湯在減少斑塊面積及維持斑塊穩定性方面較低劑量血府逐瘀湯更好，推測血府逐瘀湯抗動脈粥樣硬化斑塊和維持斑塊穩定性的作用不僅與其降脂作用有關，還與其抑制HIF-1α信號通路有關。

綜上所述，HIF-1α信號通路是血府逐瘀湯治療冠心病的核心靶點之一，血府逐瘀湯可以通過降低血脂、抑制HIF-1α信號通路而減少動脈粥樣硬化斑塊面積及維持斑塊的穩定性，進而有效治療冠心病。

作者貢獻：馬淑慧、趙學飛進行文章的構思與設計，負責撰寫、修訂論文；馬淑慧、趙學飛、王少蘭進行研究的實施與可行性分析；李敏杰進行數據收集、整理、分析；馬淑慧、董靜、王海芳進行結果分析與解釋；趙學飛負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。