臭氧-生物活性炭池反沖洗水中的微生物群落研究

陳 強，孫天曉，唐玉霖,*

(1.上海市自來水奉賢有限公司，上海 201400；2.同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092；3.水利部長三角城鎮供水節水與水環境治理重點實驗室，上海 200092)

水廠生產廢水是指在水質凈化過程中產生的廢水，主要包括沉淀池或澄清池排泥水、砂濾池反沖洗廢水及初濾水、生物活性炭池反沖洗廢水及初濾水等。在水廠中，濾池反沖洗水占水廠總水量的2%～6%[1]，水量較大，回收利用對提高水廠產水量、節約水資源具有重要意義。與原水相比，濾池反沖洗水富集了大量的污染物，回用可能會給水廠帶來風險。已有研究[2-4]對于反沖洗水的研究主要集中在理化、毒性指標和消毒副產物生成潛能等方面，結果表明反沖洗水回用不會造成出水水質指標的惡化。目前，大部分研究集中在常規處理砂濾池反沖洗水，對于深度處理工藝中生物活性炭池反沖洗水回用的研究多集中在物化指標上，對其生物特性及回用帶來的生物風險研究較少。

生物風險對于飲用水安全保障至關重要，歷史上由于飲用水中存在的細菌、病毒等多次引發了大規模水疾病暴發事件[5]。隨著飲用水水質標準不斷提高，水廠處理工藝逐漸由常規處理提升為深度處理工藝，臭氧-生物活性炭成為我國最主流的飲用水深度處理工藝，強化了對水中有機污染的去除[6-8]。顆粒活性炭的多孔結構為微生物的生長提供了理想的棲息地，微生物在炭濾池濾料上快速生長繁殖，形成具有強生物活性的復雜群落，生物量可達到609 ATP/ng[9]，微生物種類多，Shannon多樣性指數達到5.84～7.06[10-11]。此外，在炭濾池的活性炭上還檢測到致病細菌和無脊椎動物[12-13]。因此，濾池在反沖洗過程中，分析其回用的生物特性對保障飲用水安全至關重要。

本研究以上海市某臭氧-生物活性炭深度處理水廠中生物活性炭池和砂濾池反洗水為研究對象，重點檢測不同季節的炭濾池和砂濾池反沖洗水中生物量、微生物群落多樣性及時空分布特征，并對比分析反沖洗水中的生物群落結構。研究結果可為自來水廠的反沖洗水處理與回用提供指導和借鑒。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

研究在上海某臭氧-生物活性炭深度處理水廠進行，該水廠采用“預臭氧-混凝-沉淀-砂濾-后臭氧-生物活性炭-消毒”的處理工藝。其中砂濾池反沖洗周期為36～72 h，沖洗參數為氣沖4 min、氣水聯合混沖4 min、最后水沖6 min。臭氧-生物活性炭池自2018年8月投產運行，至今已使用4年，沖洗周期為36～108 h，冬季反沖洗周期較長，沖洗參數為氣沖200 s、水沖8 min。運行期間活性炭基本性能如表1所示。本研究取樣時間為2020年9月—2021年9月，反沖洗取樣時使用專一的取樣勺取樣，每次取樣前將取樣勺經酒精棉灼燒滅菌之后在水池上方取水。取樣時間點為氣沖2 min、混沖2 min和水沖第2、4 min，取砂濾池反沖洗水樣。炭濾池反沖洗水在氣沖2 min和水沖第1、3、5、7 min取樣。取樣后將樣品轉移至500 mL無菌采樣袋，并用冰袋保存，帶回實驗室分析檢測。

表1 炭濾池活性炭基本參數Tab.1 Basic Parameters of Activated Carbon in BAC Filter

1.2 檢測方法

微生物量。取1 mL樣品進行平板計數可培養細菌。R2A瓊脂用作可培養細菌檢測的培養基，水樣用0.9%無菌鹽水連續稀釋并用于平板接種。將1 mL稀釋樣品均勻涂布于培養基上，然后在28 ℃下孵育3 d進行菌落計數。

微生物群落多樣性。通過真空過濾裝置將樣品濃縮到0.22 μm孔徑的硝化纖維膜上(Millipore，美國)，將膜暫時存放-80 ℃的環境下，以便進一步分析。使用FastDNA土壤試劑盒(MP Biomedicals，CA，美國)提取基因組DNA。通過顯微分光光度法(NanoDrop-2000，Thermo Fischer Scientific，美國)測量DNA濃度和純度。使用引物338F(5’-ACTCCTACGGGGAGGAGCAG-3’)和806R(5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)從提取的DNA中擴增細菌16S rRNA基因片段(V3～V4)。PCR產物鑒定時每個樣本3個PCR重復，將3個重復的PCR產物混合并使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建MiSeq庫，Illumina MiSeq PE300平臺進行測序，測序工作在上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。

測序完成后，對測序得到的PE reads進行樣本拆分，根據測序質量對雙端Reads進行質控、過濾和拼接，獲得質控拼接之后的優化數據[14-15]。通過序列降噪方法DADA2去除優化數據中存在的PCR擴增或測序錯誤，以獲得真實的序列信息ASV(Amplicon Sequence Variant)[16]。ASV集是由關注的物種組成的一個集合，本研究基于ASV代表序列信息和豐度信息，進行后續的物種分類學分析、群落多樣性分析、物種組成分析等。

1.3 數據分析

使用Majorbio在線平臺(Cloud.Majorbio.com)用于數據統計分析[17]。使用條形圖(門和綱水平)和熱圖(屬水平)說明微生物群落結構。使用基于歐式(Bray-Curtis)距離的主坐標分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)分析反沖洗水中微生物群落組成隨季節變化的差異。

2 結果和討論

2.1 反沖洗水生物量

生物量反映微生物的數量以及生長情況，生物量越高，同樣情況下水體生物風險越高。采用R2A培養基得到的菌落總數，能較好地反映飲用水中微生物的水平，得到更為接近于實際狀態的結果，菌落總數越高，生物量越高。圖1為砂濾池和炭濾池反沖洗廢水細菌菌落總數在不同季節隨反沖時間的變化。砂濾池反沖洗水中的菌落總數冬季為3～680 CFU/mL，夏季含量顯著增加，菌落總數為30 000～783 150 CFU/mL，夏季高溫有利于細菌的生長。炭濾池反沖洗水中的菌落總數冬季高于夏季，這是因為濾池反沖洗間隔在夏季為3 d，而在冬季反沖洗間隔為7 d，炭濾池反沖洗水中的生物量在冬季較高。反沖洗可以有效去除濾料表面的生物量，反沖洗剛開始時，濾池反沖洗水中生物量較高，隨著反沖洗時間的延長，兩種反沖洗水中的生物量都有明顯的下降趨勢，初期沖洗水中的生物量均高于后期。

圖1 反沖洗過程菌落總數Fig.1 Total Number of Colonies in the Backwash Process

2.2 微生物群落多樣性

微生物群落組成可以反映微觀優勢微生物種類。為進一步了解深度處理水廠濾池反沖洗水中的微生物種類情況，研究采用16S基因測序技術對原水、砂濾池反沖洗廢水、炭濾池反沖洗廢水進行了細菌微生物群落分析。測試結果表明，原水、砂濾池反沖洗水和炭濾池反沖洗水水樣中所有的物種被標記成1 175種不同ASV序列。圖2為原水、砂濾池反沖洗水和炭濾池反沖洗水共有和特有的ASV數目，28種ASV序列同時存在于原水、砂濾池反沖洗水與炭濾池反沖洗水，955種ASV序列只出現在一種水樣中。其中，原水與砂濾池反沖洗水共有ASV數目要遠高于原水與炭濾池反沖洗水、砂濾池與炭濾池反沖洗水，表明原水與砂濾池反沖洗水在微生物群落組成方面具有更高的相似性。活性炭池中微生物的生長繁殖使得其反沖洗水中微生物群落組成復雜，與其他兩種水樣相似性較低。

圖2 原水、砂濾池反沖洗水、炭濾池反沖洗水中ASV分布Fig.2 ASV Distribution in Raw Water,Backwash Water of Sand Filter and BAC Filter

為了得到每個ASV對應的物種分類信息，對ASV代表序列進行分類學分析，獲得ASV在不同分類水平(域、界、門、綱、目、科、屬、種)的注釋信息[18]，如圖3所示。原水中門水平中占比最高的優勢菌屬為擬桿菌門(Bacteroidota)，占比高的優勢綱是擬桿菌綱(Bacteroidia)。而在砂濾池反沖洗水與炭濾池反沖洗水中門水平的優勢菌種均為變形菌門(Proteobacteria)，其中主要以α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)為主[圖3(b)]。水中的變形菌門大多能以銨鹽、硝酸鹽和氨基酸作為氮源，并能充分利用蛋白質等有機物進行水解，維持自身的生命活動，是炭濾池通過生物降解水中各類有機物的主要菌種之一。

在屬水平上，兩種反沖洗水中微生物群落組成的區別較大，如圖4所示。在α-變形菌綱中，砂濾池反沖洗水中優勢屬為新鞘氨醇菌屬(Novosphingobium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，炭濾池反沖洗水占比較高的優勢屬為念珠菌屬(CandidatusParacaedibacter)、鞘氨醇單胞菌屬、中度嗜熱雙突柄菌(Amphiplicatus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、絲狀細菌屬(Hyphomicrobium)、鞘氨醇桿菌(Sphingorhabdus)。在γ-變形菌綱中，砂濾池反沖洗水占比較高的優勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)，炭濾池反沖洗水中優勢屬極性單胞菌(Polaromonas)、軍團菌屬(Legionella)與砂單胞菌屬(Arenimonas)。本研究關于微生物群落組成的研究與上向流炭濾池的研究結果基本一致[19-20]。

圖4 不同水樣中屬水平細菌群落組成變化Fig.4 Changes of Bacterial Community Composition at the Genus Level in Different Water Samples

2.3 微生物群落季節變化

炭濾池和砂濾池反沖洗水在不同季節中微生物群落組成不同。砂濾池反沖洗水中，微生物群落組成隨著季節變化區別不大，如圖5(a)所示。但在炭濾池反沖洗水中微生物群落組成季節變化明顯，圖5(b)中變形菌門的相對豐度在冬季高于夏季，厚壁菌門的相對豐度在夏季顯著高于冬季，其對高溫有較強的耐受性。

圖5 不同季節反沖洗水門水平上微生物群落組成Fig.5 Microbial Community Composition at the Phylum Level in Different Seasons

通過基于歐式距離(Bray-Curtis)主坐標分析(PcoA)分析活性炭池不同季節反沖洗水中的物種差異度，如圖6所示。ANOSIM分析(R=0.87，P=0.007)表明，不同季節反沖洗水中微生物的結構和組成存在顯著差異，說明微生物的生長特性隨溫度的變化而不同。

圖6 不同季節反沖洗水微生物群落組成PCoA圖Fig.6 PCoA Diagram of Bacterial Community Composition in Backwash Water in Different Seasons

2.4 反沖洗周期對微生物群落結構的影響

根據水廠的實際運行，進一步分析炭濾池反沖洗周期對微生物群落結構的影響。上海市《制水廠運行規程》(T/SWSTA 0002—2019)規定，炭濾池沖洗周期根據水頭損失、濾后水渾濁度和運行時間確定，冬季沖洗周期宜為5～7 d，夏季宜為3～5 d，可根據時間情況進行調整。不同的反沖洗周期可能會影響濾池中的群落組成。因此，對炭濾池1、3、5、7 d的反沖洗水開展分析測試。圖7為不同周期炭濾池反沖洗水在門水平上的物種差異，結果表明，群落組成在不同季節變化較大，但不同周期反沖洗水中的群落組成無明顯變化規律。

3 結論

(1)濾池反沖洗可以有效去除濾料表面的生物量，隨著季節和反沖洗周期和時間的變化，濾池反沖洗水中菌落總數也隨之變化。隨著反沖洗時間的延長，兩種反沖洗水中的生物量都有明顯的下降趨勢，早期沖洗水中的生物量高于后期。因此，在反沖洗時，應更多關注反沖洗水初期的生物風險。

(2)炭濾池中微生物的生長繁殖使得反沖洗水中微生物群落組成復雜，與原水和砂濾池反沖洗水微生物組成相似性較低。原水中門水平占比最高的優勢菌屬為擬桿菌門，占比高的優勢綱是擬桿菌綱。砂濾池與炭濾池反沖洗水中門水平的優勢菌種均為變形菌門，在變形菌門中以α-變形菌綱和γ-變形菌綱為主。

(3)不同的反沖洗周期對于微生物群落組成無明顯影響。砂濾池反沖洗水中生物群落組成隨季節無顯著變化，炭濾池反沖洗水中微生物群落組成隨季節變化較大，不同季節需要根據反沖洗水微生物特性，調整反沖洗參數，選用合適的水處理回用工藝。

圖7 不同反洗周期炭濾池反沖洗水中門水平群落組成Fig.7 Bacterial Community Composition at the Phylum Level in Backwash Water in Different Backwash Cycles