microRNA調控非酒精性脂肪肝及中醫藥干預研究進展

劉穎初 汪紅兵 于金德 王雅欣 逯穎捷

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.拉薩市人民醫院，西藏 拉薩 850000；3.北京中醫醫院延慶醫院，北京 102100；4.首都醫科大學，北京 100069；5.青島中心醫院，山東 青島 266300）

1 簡介

隨著人們飲食結構及生活習慣的變化，與代謝關系密切的疾病患病率如2 型糖尿病、NAFLD、動脈粥樣硬化等逐漸升高［1］。NAFLD 是指除外酒精、藥物及自身免疫等明確損傷肝臟的原因，肝臟細胞超過5%被脂肪浸潤的病理綜合征，其被認為是代謝綜合征在肝臟的體現，若不及時診治有可能發展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化及肝癌［2］。近年來NAFLD在全球的發病率越來越高，其中以歐美、中東和亞洲患病率較高，而非洲的患病率最少。

NAFLD 發病機制尚未完全清晰，大量研究表明NAFLD 的發生發展與遺傳、環境及代謝因素有關，肥胖及胰島素抵抗被認為是NAFLD 發病的危險因素，患有糖尿病發生NAFLD 的可能性更高［3］。目前對于NAFLD 仍未找到確切、有效的NAFLD 靶向藥物。MicroRNA 作為近年來研究代謝類疾病的熱點，研究發現參與NAFLD 的發病發展機制，并影響NAFLD 的胰島素代謝和脂質代謝，為NAFLD 的早期診斷、治療和病情監測提供了新方向、新思路。因此miRNA或許可以作為緩解或治療NAFLD 的有效切入口，并為以后研制NAFLD特效藥提供依據及思路。

1.1 胰島素抵抗

胰島素是一種多效性激素，其主要作用為刺激糖的轉運及抑制脂肪的溶解，使血循環中非酯化脂肪酸減少。胰島素抵抗（IR）是指正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態，指單位濃度的胰島素其細胞效應減弱，由于各種原因導致的胰島素促進葡萄糖攝取和利用效率減弱，機體代償性的分泌過多的胰島素產生高胰島素血癥。其主要發生在胰島素效應器官，如肝臟、骨骼肌、脂肪組織等，肝臟作為胰島素作用的主要靶器官之一，通過調節糖類和脂質的代謝以維持糖脂濃度在正常的生理范圍內［4，5］。胰島素抵抗的實質為胰島素介導的細胞糖代謝能力減低。

1.2 NAFLD病因及發病機制

NAFLD 是由多因素共同作用導致的一類病理綜合征，早期的診斷及干預治療能有效緩解病情進展。目前“多重打擊”學說作為NAFLD 的發病機制受到國際學者的普遍認可，“多次打擊”模型是指遺傳、環境、飲食等因素共同作用于肝臟，導致肝臟胰島素抵抗的發生，這是第一次打擊，而后引起一系列細胞炎癥反應、線粒體代謝失調、氧化應激導致肝臟細胞纖維化甚至壞死，這是第二次沖擊［6,7］，故胰島素抵抗被認為是NAFLD發病的始動因素［8］。在第一次打擊中，若胰島素信號傳導通路受損，使體內血糖濃度升高，機體則會代償性分泌過多的胰島素從而引起胰島素抵抗，同時體內過量的葡萄糖則會轉變為脂質沉積于肝臟中，使肝臟脂質代謝紊亂從而進一步加重胰島素抵抗，如此惡性循環［9］。

2 miRNA參與調控NAFLD

miRNA 是一類存在于真核生物體內不編碼蛋白質的微小RNA，長度約為22 個核苷酸左右，其進化為具有高度保守性，成熟的miRNA與靶蛋白相結合形成沉默復合體，使靶基因表達上調或下調，通過調控轉錄后水平的表達從而調節細胞代謝、信號轉導、炎癥應激等反應［10］。miRNA 近年來也被認為是潛在診斷和治療疾病生物標志物，它在生物體內的異常表達可以衍生一系列疾病病理的發生發展［11］。同時miRNA對于生物體表達的調控是多元性、多位點、多層次的，并非單靶點生物軸的作用機制［12］，這也與中醫藥治療整體觀念的治療理念相契合。

miRNA 在參與脂質代謝及胰島素抵抗中發揮重要作用，進而參與NAFLD 的發病進程［13］。研究發現，與健康對照者相比，NAFLD 患者體內的miRNA 表達多異常（上調或下調），通過與下游靶基因結合參與調控脂代謝的關鍵酶的合成，導致肝細胞內甘油三酯及脂肪酸堆積或分解［14］。胰島素抵抗會使體內過量的葡萄糖及脂質沉積于肝臟中，誘發肝細胞炎癥，是NAFLD的關鍵打擊因素，而胰島素信號傳導通路受損會進一步加重胰島素抵抗，如此惡性循環［15］。miRNA通過參與胰島素抵抗的表達，改善胰島素敏感性，間接減輕NAFLD 的發生發展［16］。肝活檢對肝臟疾病的確診至關重要，但可能會帶來相對嚴重的并發癥，而miRNA 對于診斷治療肝臟相關疾病是非侵入性的，故用微小RNA 作為評估和篩查非酒精性肝病的生物標志物具有良好的前景和研究空間。

2.1 miRNA與能量代謝

胰島素抵抗是NAFLD 不同發病機制的共同起始途徑，高糖環境下胰島素抵抗，使肝細胞對血糖的代謝增強，影響脂質代謝，使脂肪堆積于肝細胞內，導致肝功能異常。

膽固醇調節元件結合蛋白（SREBP）是miR-33 的靶蛋白，兩者含量呈正相關，miRNA-33 表達上調，SREBP 增多，抑制胰島素轉導代謝，導致肝臟膽固醇合成增加，加重NAFLD 大鼠脂肪變性程度［17］。高糖環境下SREBP表達量升高，進而導致胰島素抵抗及肝脂肪變，可能與miR-34a 表達上調相關。通過敲除大鼠模型體內miRNA-33 基因的表達，可以觀察到MMP-2、MMP-9 及TNF-α 合成減少，促進膽固醇外流，改善脂代謝進而減輕肝臟脂肪化［18］。miRNA-33不僅可以調節膽固醇外流，還可以調節循環內高密度脂蛋白膽固醇含量，抑制miRNA-33 的表達可以增加膽固醇相關準運基因的表達，促進膽固醇外流和循環內HDL的表達［19］。

去乙酰化酶1(sirtuin1,SIRT1)參與細胞周期、代謝、發育過程，AMPK 可以促進生物體內的糖代謝及脂肪代謝，均是miR-34a 的靶基因。Ding 等［20］發現高脂飲食誘導的小鼠肝細胞中miR-34a 表達增加會負向調節SIRT1/AMPK 通路，通過向小鼠尾靜脈注射miR-34a 抑制劑后，SIRT1/AMPK 表達增加，促進脂肪的分解，有效緩解胰島素抵抗和肝臟脂肪變性，進一步證實miR-34a 與SIRT1 之間存在負反饋調節關系。由此可知，miRNA-34a很有可能參與胰島素抵抗的發生，抑制大鼠體內miRNA-34a 的表達可以激活SIRT1通路，促進AMPK 的表達，改善葡萄糖耐量及胰島素敏感性，相反地miRNA-34a表達上調會導致脂肪變性及胰島素抵抗加重，促進糖尿病及NAFLD的發生。

miR-122、miR-155 被發現在高脂飲食誘導的小鼠體內表達下調，與NAFLD 具有明顯相關性，可能是NAFLD 的潛在治療靶點。miR-155 通過微調肝內脂肪相關轉運蛋白作為調控NAFLD 的關鍵節點，miR-155與LXR/SERBP2/FAS軸含量呈正相關，miR-155增加能夠促進肝胰島素分泌及脂肪分解，緩解脂肪堆積。miR-122 在人體肝臟中含量相對豐富，占肝臟miRNA 總量的70%，對肝脂質變性具有保護作用。采用膽堿和葉酸缺乏的飼料誘導近交系雄性小鼠產生NAFLD樣肝損傷，觀察到miR-122表達水平降低。進一步體外研究發現，過表達miRNA-122 則會抑制YY1-FXR-SHP 調節軸，減少肝內脂質的合成，緩解NAFLD進展［21］。

2.2 miRNA與炎癥反應、氧化應激

炎癥損傷與氧化應激可造成肝細胞損傷，是NAFLD 的發病因素。低密度脂蛋白相關受體（LRP6）是Wnt 信號通路的關鍵因子，Wnt 通路與細胞炎癥反應關系密切。miR-21 可以負向調節LRP6 的表達，抑制Wnt 通路，加重炎性反應。Wang 等［22］發現，通過向非酒精性脂肪肝小鼠模型中注射miR-21 后LRP6 表達減少，導致脂代謝紊亂誘發肝臟炎癥。既往早期研究也表明，miR-21 在大鼠體內表達上調后，會導致磷酸酶和張力蛋白同系物（PTEN）下調，誘發肝臟脂肪變性。

miR-29 可能是NAFLD 的保護因子，核因子kB(NF—kB)體系主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激等過程的信息傳遞。Yang 等［23］利用蛋氨酸缺乏飲食誘導小鼠模型體內miR-29 表達上調，NK-kB 及促炎細胞因子表達下調，減輕肝臟炎癥及脂肪變性，這可能與識別受體TLR2/TLR4 來調節機體免疫代謝過程相關。有研究報道，miR-29a 通過靶向調節脂蛋白脂酶(LPL)，減輕肝臟中脂質蓄積，參與脂質分布的重新編程，這可能是防止脂肪變性及炎癥的原因［24］。

miRNA-192 可能是NAFLD 的保護因子，高脂高膽固醇飲食誘導的大鼠模型中，miRNA-192水平與肝巨噬細胞及促炎介質的數量呈正比例增加。其主要分子機制為miRNA-192 激活相關炎癥因子如白細胞介素6 和腫瘤壞死因子α 等，導致FoxO1 靶蛋白激活，誘導大鼠非酒精性肝病的加劇［25］。對NAFLD 合并急性胰腺炎患者的血清進行檢測，發現miRNA-192 含量較對照組下調，恢復其正常表達水平則可有效改善胰腺細胞炎癥，減輕細胞凋亡率，改善肝細胞炎癥。此外，敲除小鼠內miRNA-192 后產生了吡格列酮抗藥性，導致胰島素抵抗加重，肝脂肪細胞堆積。越來越多研究表明，miRNA-192 不僅可以作為脂代謝的節點因子，更是提高胰島素敏感性的重要調控靶點之一，生物體內過表達miRNA-192 可以促進SCD-1 介導的脂質沉積，有效改善肝內胰島素抵抗及脂質代謝［26］。

3 miRNA與NAFLD 中醫論治

目前國際上尚未找到滿意的NAFLD 治療藥物，醫生們多建議通過減肥、保持良好飲食習慣或調解腸道微生物來緩解病程［27］。亞洲國家近年來運用中醫越來越多，一項研究表示中草藥作為肝病的補充療法有效率及不良反應較對照組相對改善［28］。通過中醫藥的干預，NAFLD 發展為NASH 的過程減緩，眾所周知的是NAFLD 的發生發展過程是多器官、多命中的，而中草藥對于身體疾病的治療作用也是整體性、多靶點的，這也是中醫可以用來治療NAFLD 的理論契合點［29］。

3.1 NAFLD中醫病因病機

NAFLD 在傳統醫學中屬于“脅痛”“痞滿”“積聚”等范疇，《素問》有云：“濁氣在上,則生嗔脹”，肝失疏泄,脾虛不運,精微不布,聚濕生痰,壅于肝臟,發為脂肪肝，其中脾虛濕蘊為NAFLD 的關鍵病機［30］。《臨證指南醫案·濕》云:“而但濕從內生者,必其人膏梁酒醴過度。”《醫學入門》中所云:“善食厚味者生痰”。過食肥甘厚味,阻礙脾胃運化,脾失健運,水谷精微不能輸布轉化為營衛氣血,反成痰濁膏脂,痰濁內蘊,蘊結于肝,發為本病。鄭佳連等［31］研究212例NAFLD患者中有體質量指數BMI超標164例,提示多數NAFLD 患者體質量超重,考慮可能其過食肥甘之物,導致脾胃運化不及,痰濕聚集而發病。

此外，勞逸失常,憂思傷脾,或病后正氣虛弱,或肝臟失養,氣機不暢影響脾之健運,均可使脾失健運，生濕化痰,發為本病。鄭玨［32］通過對602 例非酒精性脂肪肝患者辨證分型與體質量指數、血脂的關系研究發現，NALFD患者以肝郁脾虛證最多見。痰濕日久化熱，濕熱瘀結于肝，血行不暢,脈絡壅塞,痰濁與氣血搏結于肝膽,形成脂肪肝［33］。張艷彬［34］對246 例患者7 種中醫體質類型進行分析,構成比例由高到低前3位分別為氣虛質、痰濕質和濕熱質。說明氣虛質、痰濕質和濕熱質三種體質的人更容易患NAFLD，同時在治療上根據中醫辨證論治原理,給予補氣、健脾、利濕,并化痰瀉濁治療,達到防治效果。

3.2 中醫藥對胰島素抵抗相關miRNA的調節

NAFLD 治療中常使用健脾疏肝，清熱利濕之法，中藥治療NAFLD 可能不會改變肝細胞基因的微觀結構，但可以通過調節miRNA的活性變化來調控基因表達，在NAFLD 的發病中起關鍵作用。胰島素抵抗是NAFLD進展的重要機制，近年來對于中醫藥在微觀層面改善胰島素抵抗的研究不斷增多，觀察中醫藥對miRNA 表達的變化有助于從表觀遺傳層面解釋中醫藥對疾病的作用機制。王澤［35］通過基因芯片高通量檢測發現，清潤湯對于胰島素抵抗導致的2 型糖尿病具有一定的臨床療效，可能與對miR-34a-SIRT1/NKkB 信號通路的作用相關。隋淼［36］研究顯示小檗堿可通過下調miR-146b 的表達，促進SIRT1 的表達，降低FoxO1 乙酰化，改善肝臟胰島素抵抗。Mao 等人運用含有黃芪、白術、五味子、赤芍等補脾化濕中藥可以通過調控miR-29a及其下游基因IRS-1及其磷酸化蛋白等靶基因減輕胰島素抵抗及肝細胞炎癥，這也證明了miR-29a 在糖尿病性脂肪肝大鼠模型肝臟胰島素受體信號轉導中起重要作用［37］。

Hong 等［38］運用網絡藥理學分析益氣補腎調脂方抗肝臟脂肪變性及炎癥的miRNA機制，認為益氣補腎調脂方通過作用于miR-106b-3p 及靶蛋白MMU-let-7a/b-5p 潛在調節細胞炎癥應激、氧化和免疫。黃芪多糖可能通過上調肝內miR-203a 表達水平，降低葡萄糖調節蛋白78及調節肝臟內質網應激信號轉導，發揮減弱肝細胞內胰島素抵抗的作用［39］。黃連素通過抑制microRNA-29a 表達刺激PPARγ、SREBP、LXR 等靶蛋白，減少血糖、甘油三酯以及膽固醇在肝內蓄積，發揮抗IR 及NAFLD 的作用［40］。茵陳有清利濕熱、利膽退黃之功效，茵陳可以下調糖尿病模型大鼠腎臟組織 中miR-21的表達，導致Smad7、TGF-β1以及Smad2/3等蛋白的表達增加，緩解胰島素抵抗作用［41］。

4 總結與展望

尋找合適有效的療法對于緩解NAFLD 發生發展有明顯意義，但目前的治療方法相對局限。miRNA可以調控多靶點基因，近年來中草藥對于NAFLD 的治療意義顯著提高，其對于miRNA/NAFLD 作用的機制仍需要進一步完善，以期為未來的NAFLD 治療帶來更合理的方案。相信隨著生物信息學和高通量基因篩查技術的深入研究，在中醫藥通過miRNA 治療NAFLD相關作用機制及提高臨床療效等方面，會有更大的突破與飛躍。