美登素衍生物DM1聚合物雜質聚合物1的合成研究

朱陽 姚長亮 夏廣兵

（上海醫藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

DM1 是 N2′-去乙酰基 -N2′-（3-巰基 -1-氧代丙基）美登素的英文簡稱。DM1是一種能夠抑制細胞分裂的微管蛋白抑制劑，其與曲妥珠單抗通過偶聯方式形成靶向抗腫瘤藥物T-DM1[1]，后者的商品名為Kadcyla，2013年2月獲得美國FDA批準，用于治療人表皮生長因子受體-2陽性的晚期乳腺癌患者。

在DM1的制備過程[2-4]中，會產生一種DM1聚合物“聚合物1”（圖1）。聚合物1是DM1制備過程中產生的雜質，故須在DM1成品中予以嚴格控制。制備聚合物1并進行相關研究，對于選擇合適方法有效控制甚至去除此雜質，進而提高DM1乃至T-DM1的質量具有重要的意義。

圖1 DM1（左）和聚合物1（右）的化學結構

有文獻[2]報告了聚合物1的制備方法：將DM1溶于由磷酸緩沖液和乙醇組成的混合液中，在2, 2'-二硫二吡啶存在的條件下使DM1發生脫氫聚合生成聚合物1，最后通過濃縮、萃取、洗滌、減壓蒸餾等，殘余物再用色譜柱分離制得純聚合物1。我們按文獻操作，發現收率非常低，制備困難。對此，我們通過大量實驗摸索，發現DM1在1, 3-二甲基-2-咪唑啉酮（1, 3-dimethyl-2-imidazolidinone, DMI）或N, N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide, DMF）等有機溶劑中很容易發生二聚化而生成聚合物1。利用該法制備聚合物1，操作簡便且易獲得高純度的聚合物1，經檢索未見有相似研究報告。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Bruker Ascend 400 MHz核磁共振波譜儀（nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR）（內標：四甲基硅烷）；Agilent 1260高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography, HPLC）等。

1.2 試劑

DM1（自制，合成路線見圖2，HPLC檢測純度＞99%）；安絲菌素P-3（ansamitocin P-3, AP3）（HPLC檢測純度＞95%)、DMI（HPLC檢測純度＞98%）等試劑均為市售分析純試劑。

圖2 DM1合成路線

2 制備方法

2.1 DM1的制備

2.1.1 DM1-2制備

在反應瓶中加入500 mL四氫呋喃，氬氣保護下壓入300 mL 1 mol/L四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液，冷卻至＜-45 ℃后慢慢滴加30 g無水甲醇，內溫控制在-45 ～-35 ℃，制得LiAl(OMe)3待用。將10.0 g（15.76 mmol）AP3溶于200 mL四氫呋喃中，然后快速滴加至上述LiAl(OMe)3中，氬氣保護，于-45 ～ -35 ℃反應1.5 h。反應結束后，加入150 mL飽和氯化銨水溶液淬滅反應，再加入300 mL乙酸乙酯進行萃取，分出有機相，加入無水硫酸鎂脫水干燥1 h左右。過濾，（30±5）℃下減壓蒸餾，得8.8 g（15.57 mmol）泡狀固體即DM1-2，收率98.8%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 7.18（d, J=1.5 Hz,1H），6.88（d, J=1.5 Hz, 1H），6.51（s, 1H），6.49（dd,J=11、15 Hz, 1H），6.13（d, J=11 Hz, 1H），5.50（dd,J=9、15 Hz, 1H），4.40（d, 1H），4.09（m, 1H），3.96（s,3H），3.46（d, 1H），3.44 ～ 3.45（d, 2H），3.33（s, 3H），3.18（s, 3H），3.12（d, J=12 Hz, 1H），2.58（d, J=9 Hz,1H），2.28（dd, 1H），2.09（dd, 1H），1.65（s, 3H），1.54（m,1H），1.25（d, 3H），1.22（d, 2H），0.79（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質譜檢測均確證所得物質為DM1-2。

2.1.2 DM1-3a制備

在反應瓶中分別加入9.6 g（74.42 mmol）DM1-1、8.5 g（15.01 mmol）DM1-2和 130 mL DMF， 氬 氣保護下攪拌溶解。控制溫度＜10 ℃，分批加入催化劑Zn(CF3SO3)2（共18 g）和N, N-二異丙基乙胺（共15 g），15 ～ 20 ℃攪拌反應過夜。翌日，加入200 mL飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應，然后加入200 mL飽和氯化鈉水溶液，攪拌5 ～ 10 min，再用500 mL乙酸乙酯萃取共3 ～ 5次。分出并合并有機相，用500 mL水和500 mL飽和氯化鈉水溶液分別洗滌后，于（30±5）℃、0.08 MPa條件下減壓蒸餾至干，得12.5 g DM1-3a粗品。以柱層析純化，采用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫。收集產物流分，（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得8.7 g（13.38 mmol）黃色固體即DM1-3a，收率89.1%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 6.87（d, J=1.5 Hz,1H），6.85（d, J=1.5 Hz, 1H），6.43（dd, J=11、15 Hz,1H），6.14（d, J=11 Hz, 1H），5.52（dd, J=9、15 Hz,1H），4.94（dd, J=3、12 Hz, 1H），4.26（m, 1H），3.98（s,3H），3.69（q, 1H），3.50（d, 1H），3.49（d, 1H），3.37（s, 3H），3.23（dd, 1H），3.12（s, 3H），2.59（d, J=12 Hz, 1H），2.54（d, J=9 Hz, 1H），2.37（s, 3H），2.19（dd,J=3、14 Hz, 1H），1.67（s, 3H），1.58（d, J=13 Hz, 1H），1.38（m, 1H），1.30（d, 3H），1.27（d, 3H），1.24（d,1H），0.84（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質譜檢測均確證所得物質為DM1-3a。

2.1.3 DM1-3L制備

在反應瓶中分別加入7.5 g（11.54 mmol）DM1-3a和60 mL二氯甲烷，攪拌溶解后再依次加入7.6 g 3-（甲基二硫烷基）丙酸和8.8 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫攪拌反應3.0 h。然后，依次向反應瓶中加入60 mL pH為6的磷酸緩沖液和30 mL二氯甲烷，攪拌，分出有機相，水相用30 mL二氯甲烷萃取。合并有機相，用水洗滌2次后于（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得10.5 g DM1-3L粗品。粗品用50 mL乙醇重結晶2次，得5.1 g（6.50 mmol）白色固體即DM1-3L，收率56.3%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 6.82（d, J=1.5 Hz,1H），6.73（d, J=11 Hz, 1H），6.64（d, J=1.5 Hz, 1H），6.44（dd, J=11、15 Hz, 1H），6.30（s, 1H），5.66（dd,J=9、15 Hz, 1H），5.42（q, J=7 Hz, 1H），4.77（dd, J=3、12 Hz, 1H），4.26（m, 1H），3.98（s, 3H），3.69（d, J=12 Hz, 1H），3.46（s, 1H），3.55（d, J=9 Hz, 1H），3.35（s,3H），3.23（s, 3H），3.12（d, J=12 Hz, 1H），3.09（d,J=9 Hz, 1H），2.90（m, 2H），2.88（s, 3H），2.85（m,2H），2.60（m, 1H），2.26（s, 3H），2.17（dd, J=3、14 Hz, 1H），1.98（s, 1H），1.64（s, 3H），1.55（d, J=13 Hz, 1H），1.46（m, 1H），1.23 ～ 1.31（m, 6H），1.21（d,J=13 Hz, 1H），0.80（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質譜檢測均確證所得物質為DM1-3L。

2.1.4 DM1制備

將5 g（6.37 mmol）DM1-3L粗品和5.1 g DL-二硫蘇糖醇用由120 mL乙酸乙酯和120 mL甲醇組成的混合液溶解后，加入120 mL pH為7.5的磷酸緩沖液，氬氣保護下室溫反應3.5 h。然后，加入240 mL pH為6.0的磷酸緩沖液，用120 mL乙酸乙酯萃取，有機相用30 mL水洗滌5次，再于（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得5.2 g DM1粗品。以柱層析純化，采用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫。收集產物流分，（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得4.1 g（5.55 mmol）白色固體即DM1，收率87.1%，HPLC檢測純度＞99%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 6.86（d, J=1.5 Hz,1H），6.75（d, J=11 Hz, 1H），6.69（d, J=1.5 Hz, 1H），6.46（dd, J=11、15 Hz, 1H），6.29（s, 1H），5.66（dd,J=9、15 Hz, 1H），5.45（q, J=7 Hz, 1H），4.78（dd, J=3、12 Hz, 1H），4.26（m, 1H），3.99（s, 3H），3.69（d, J=12 Hz, 1H），3.55（d, J=9 Hz, 1H），3.46（s, 1H），3.37（s,3H），3.22（s, 3H），3.12（d, J=12 Hz, 3H），3.04（d,J=9 Hz, 1H），2.86（s, 3H），2.60 ～ 2.83（m, 5H），2.19（dd,J=3、14 Hz, 1H），1.78（s, 1H），1.68（s, 3H），1.58（d,J=13 Hz, 1H），1.43 ～ 1.63（m, 1H），1.27 ～ 1.35（m,6H），1.24（d, J=13 Hz, 1H），0.81（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質譜檢測均確證所得物質為DM1。

2.2 聚合物1的制備

2.2.1 方法一

將1.5 g（2.03 mmol）DM1加至由40 mL DMI和40 mL水組成的的混合液中，室溫攪拌20 h左右，至反應液中已逐漸有白色固體析出且HPLC檢測顯示DM1完全消失止。加入200 mL水，攪拌并冷卻到0 ～ 5 ℃，1 h后過濾。濾餅用少量80%乙醇水溶液洗滌，然后真空干燥，得1.2 g（0.81 mmol）白色固體即聚合物1，收率79.8%，HPLC檢測純度＞98%。

1H-NMR（400 MHz, 二甲基亞砜 -d6）：δ 7.17（d,J=1.2 Hz, 1H），6.87（s, 1H），6.69 ～ 6.44（m, 3H），5.91（s, 1H），5.68 ～ 5.47（m, 1H），5.31（q, J=6.6 Hz, 1H），4.54（dd, J=2.5、12.0 Hz, 1H），4.08（t, J=11.8 Hz, 1H），3.94（s, 3H），3.50（d, J=9.0 Hz, 1H），3.45（d, J=12.4 Hz, 1H），3.27（s, 3H），3.18（d, J=12.5 Hz, 1H），3.10（s,3H），2.84 ～ 2.74（m, 2H），2.70（s, 3H），2.57 ～ 2.45（m,4H），2.05（d, J=12.1 Hz, 1H），1.60（s, 3H），1.46（d,J=12.9 Hz, 2H），1.27（d, J=3.4 Hz, 1H），1.18（d, J=6.8 Hz, 3H），1.13（d, J=6.3 Hz, 3H），0.79（s, 3H）。

電噴霧電離質譜：[M+H]+計算值為1 473.53，實測值是1 473.56。

1H-NMR、13C-NMR、DEPT、COSY、HSQC、HMBC和質譜檢測均確證所得物質為聚合物1。

2.2.2 方法二

將100 mg（0.136 mmol）DM1加至4 mL DMF中，攪拌加熱至80 ℃反應31 h。然后，冷卻到室溫，加入20 mL水，繼續攪拌冷卻到0 ～ 5 ℃。1 h左右后過濾，濾餅用水洗滌，得100 mg白色固體即聚合物1粗品。以1 cm×10 cm硅膠柱純化，采用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫。收集產物流分，于（30±5）℃、0.08 MPa條件下減壓蒸餾至干，得65 mg（0.044 mmol）白色固體即聚合物1，收率64.7%，HPLC檢測純度為95%。

3 結果與討論

本研究是在研究DM1制備過程中對DM1的聚合物雜質聚合物1進行的合成研究。我們通過實驗摸索發現，DM1在DMI、DMF等有機溶劑中很容易發生二聚化而生成聚合物1，尤其是在選用市售DMI為溶劑時，經過簡單操作，不需繁瑣的后處理或柱層析純化，即能獲得高純度的聚合物1，可直接用作DM1有關物質質量控制的對照品。此外，這一發現也提示我們，欲在DM1制備過程中有效控制甚至避免聚合物1的產生，必須在DM1制備過程中盡可能不使用DMI、DMF等有機溶劑，此有利于獲得高純度的DM1及其產業化。

致謝：感謝上海醫藥集團股份有限公司中央研究院的質量研發團隊與所有參與此項目研究的同事們的大力支持。