雷帕霉素脂質體的處方及工藝研究

孫聚魁 曹金娜

（1. 上海創諾制藥有限公司 上海 201399；2. 上海市醫藥學校 上海 200135）

脂質體作為囊泡類載體的一個典型代表，可包封水溶性藥物和脂溶性藥物，因其具有選擇性高、靶向性強、療效高等優點而廣受關注[1]，如今脂質體已經成為制劑學科一個十分活躍的領域[2]。在目前的研究中，雖然脂質體仍然以靜脈注射為主，但隨著近年來技術的發展，口服脂質體也在逐漸的成為研究的熱點[2-5]。

雷帕霉素（rapamycin）是1975年由加拿大研究室Ayerst自太平洋Easter島土壤中分離的鏈霉菌次級代謝物，后發現其對自身免疫性疾病具有免疫抑制作用而作為器官移植排斥的免疫抑制劑[6-8]，目前已完成其化學結構的全合成。雷帕霉素為難溶性藥物，不但溶出受限，而且對酸、堿均不穩定，這導致其口服液和片劑的生物利用度均較低，并且吸收和代謝存在較大的個體差異[9]。脂質體可以改變雷帕霉素在水性介質中的分散穩定程度，適合作為口服或注射等多種給藥方式的載體[10]。本研究對雷帕霉素脂質體制備方法及處方進行了優化，并對其部分關鍵性質進行了測定。

1 材料和方法

1.1 儀器和試藥

L-2130泵、L-2400紫外檢測器（日本日立公司）；N2000色譜數據處理系統（北京天美科技有限公司）；ZFQ85A旋轉蒸發儀（上海醫械專機廠）；LIPEXEXTRUDER擠出儀（加拿大Northernlipids公司）；激光粒度測定儀（英國馬爾文公司）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；DL-水浴超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。

雷帕霉素原料藥（上海齊奧化工有限公司）；大豆卵磷脂SPC- Epikuron 200（德國Degussa公司）；葡聚糖凝膠（Pharmacia公司）。

1.2 雷帕霉素脂質體的制備及優化

1.2.1 薄膜分散法

將處方量的磷脂、膽固醇、藥物按一定比例混合，溶于適量氯仿中，然后減壓旋轉蒸餾除去氯仿，使脂質及藥物在器壁上形成薄膜。加入水化介質（磷酸鹽緩沖液），水化薄膜使之成為脂質體，擠出整粒后，即得[11]。

1.2.2 逆向蒸發法

將處方量的磷脂、膽固醇、藥物按一定比例混合，溶于乙醚-氯仿（1∶1）中，加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL，加0.2 mol/L氫氧化鈉118 mL，用水稀釋到1 000 mL，搖勻，pH 6.8），使有機相和水相體積比為3∶1，進行水浴超聲（室溫，不少于20 min），直至形成穩定W/O型乳劑。然后減壓蒸餾除去有機溶劑，達到膠態后，加入磷酸鹽緩沖液，繼續減壓蒸餾除去殘留有機溶劑，將制得的脂質體進行擠出整粒，即得[12]。

1.2.3 乙醇注入法

將處方量的磷脂、膽固醇、藥物混合，溶于無水乙醇，勻速緩慢地注入到45 ℃磷酸鹽緩沖液中，減壓蒸餾除去乙醇，將制得的脂質體擠出整粒[13]。

1.3 雷帕霉素脂質載藥效率的測定方法

取雷帕霉素脂質體混懸液5 mL擠出，棄去初濾液0.3～0.5 mL后，從續濾液中取0.20 mL于10.00 mL容量瓶中，甲醇定容至10.00 mL。色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流動相：甲醇 -水（85 ∶ 15）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：277 nm；柱溫：50 ℃；進樣量20 μL，測峰面積，換算脂質體中藥物濃度。并以公式R=Ci/C0×100%（R：載藥效率；Ci：實際濃度；C0：投藥量計算理論濃度）計算載體對藥物的裝載能力。

1.4 顯微形態觀察

利用透射電鏡觀察脂質體粒度分布和形態結構，采用磷鎢酸負染法處理樣品，具體操作如下：室溫條件下，分別取雷帕霉素脂質體混懸液，加入蒸餾水稀釋適當倍數，分別滴加在碳膜覆蓋的銅網上，使脂質體混懸液在銅網上停留2～3 min，用濾紙吸走多余的液體，用2.0%磷鎢酸鈉液染色3 min，再用濾紙吸走多余的液體，染色后的銅網自然晾干，置JEM-1200EX透射電子顯微鏡下觀察，照相。

2 結果

2.1 不同載藥方法載藥效率對比

薄膜分散法、逆向蒸發法、乙醇注入法制得的脂質體載藥效率分別為（62.82±5.79）%、（12.75±1.26）%、（38.35±2.38）%。在處方相同情況下，薄膜分散法制備的脂質體的載藥效率更高。

2.2 薄膜分散法制備雷帕霉素脂質體的處方優化

2.2.1 磷脂-藥量比對載藥量的影響

固定處方中磷脂用量、磷脂膽固醇比例及水相pH，分別以不同雷帕霉素/磷脂質量比的投藥量制備脂質體。結果表明，藥脂比增加對載藥量有一定影響；當投藥量固定，磷脂用量較大時，藥脂比對載藥量影響不大（表1）。

表1 磷脂-藥量比對載藥效率的影響

2.2.2 磷脂-膽固醇比對載藥量的影響

固定處方中磷脂的用量、藥脂比及水相pH，改變膽固醇用量，分別以不同磷脂-膽固醇質量比為制備脂質體。結果表明，膽固醇的加入降低了載體對藥物的裝載能力。但考慮到膽固醇對載體的穩定性有積極作用，故采用10∶1的磷脂-膽固醇比例作為最優比例（表2）。

表2 磷脂-膽固醇比對載藥效率的影響

2.2.3 水化介質pH對載藥量的影響

固定處方中磷脂用量、磷脂膽固醇比及藥脂比，分別以水和不同pH的磷酸鹽緩沖液為水化介質制備脂質體。結果表明，水化介質pH對藥物載入量有較大影響，在pH小于4或大于5時，載藥效率較低，但考慮到生理環境等因素，最終采用pH 7.0作為產品的分散介質（表3）。

表3 水化介質pH對載藥效率的影響

2.2.4 最終處方驗證

綜合考慮脂質體穩定性等因素，確定處方如下：磷脂100.00 mg，膽固醇10.00 mg，雷帕霉素4.00 mg，氯仿溶解，除去有機溶劑。以pH 7的磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液29.1 mL，用水稀釋至100 mL）5.00 mL為水化介質進行水化。脂質體依次過0.8、0.45、0.22和0.1 μm的微孔濾膜各5遍進行整粒，得雷帕霉素脂質體。制備3批脂質體，測得載藥效率為（79.48 ± 4.25）%。

2.3 雷帕霉素脂質體的形態研究

2.3.1 顯微形態觀察

雷帕霉素脂質體的電子顯微鏡觀察表明，其成類球形，粒子分布比較均勻（圖1）。

圖1 雷帕霉素脂質體透射電子顯微鏡典型視野(×20 000)

2.3.2 雷帕霉素脂質體粒徑及分布

室溫（約20 ℃）條件下，雷帕霉素脂質體粒徑均勻且分布較窄，平均粒徑為222.2 nm，多分散性指數為0.268。

2.3.3 雷帕霉素脂質體載藥效率

對制備的脂質體進行載藥效率的測試，其載藥效率為（79.48 ± 4.25）%。折算制劑的藥物質量濃度為（636±34）μg/mL。

2.3.4 雷帕霉素脂質體突釋檢查

37 ℃條件下，取雷帕霉素脂質體至于透析袋中，將透析袋置于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，并測定緩沖液中藥物濃度，計算制劑在6 h內的釋放情況。結果顯示其6 h內的累計釋放量小于10%，突釋效應很小，符合中國藥典要求。

3 討論

理想的脂質體應該具有較高的藥物裝載效率。水溶性藥物的載藥效率通常以包封率為指標，即脂質體內水相藥量與體系中全部藥量的比值。而目前對于脂溶性藥物的脂質體制劑而言，多數稱之為增溶[14]，即藥物存留在磷脂雙分子層中或吸附于脂質體表面而隨脂質體一同均勻、穩定的分散于水相中。因此，包封率對脂溶性藥物而言并不夠準確，本研究使用了載藥效率作為衡量制劑承載雷帕霉素能力的指標。此外，文獻[15]報道，由于雷帕霉素較強的脂溶性，使得幾乎全部的分子形式存在的藥物存在于磷脂雙分子層中，因此當體系中游離藥量可以忽略時，包封率難以準確評價載體的載藥能力。綜合以上因素及，及制備過程中藥物可能發生的降解，故本研究使用了載藥效率的概念，以脂質體攜帶的藥物與投藥量進行比較。

在脂質體的制備方法研究中，嘗試了使用乙醇注入法、逆向蒸發法和薄膜分散法制備脂質體，結果表明，在處方固定的情況下薄膜分散法制備的脂質體載藥效率較高。這可能與三種方法載藥的機理不同有關。乙醇注入過程中，由于注入及減壓蒸餾除醇過程中會多次發生乙醇/水比例的變化，而使初期溶解在乙醇中磷脂、膽固醇因極性變化而析出，自發的形成脂質體，但是當藥物和膜材析出不能同步實現的時候，可能會出現兩種情況：①藥物析出，而膜材仍然以分子狀態存在；②膜材發生聚集，藥物尚未析出，這兩種情況都不利于藥物的裝載。而逆向蒸發過程中，先形成油包水型乳劑，然后在減壓蒸餾除去有機溶劑過程中乳滴之間相互靠近，磷脂由原本的單分子層相互融合成雙分子層，在這個過程中，由于粒子曲率的改變，必然導致部分乳滴的破裂，這一破裂過程對藥物的裝載是不利的。相比之下，薄膜分散法不存在以上過程，在溶劑除去過程中，膜材和藥物的析出基本上是同步形成薄膜的，不會出現乙醇注入過程中出現的不同步析出；而在水化過程中雖然薄膜完整性發生變化，但藥物與磷脂結合的微觀結構不會發生根本改變，因此其載藥量相對較高。張振華等[16]采用乙醇，通過薄膜分散法制備了脂質體，并取得了良好的眼用效果。考慮到乙醇中有醇羥基存在，乙醇完全去除所需時間較長，同時考慮到乙醇有一定極性，可能會在溶劑去除過程中，使溶解度較低的膽固醇更早析出。因此，本研究嘗試使用極性較低的乙醚-氯仿體系制備脂質體，并通過優化，制備獲得的脂質體的載藥效率在80%左右，其外觀成囊泡狀且粒度均一。

在研究過程中也發現，雷帕霉素分子量較高，具有一定剛性，其分布在磷脂雙分子層中可能會使磷脂膜的柔性下降，如果后續研究中能在增加穩定性的前提下，提高磷脂雙分子層的柔性，可能會對生物吸收有進一步的積極作用。