QuEChERS前處理技術在動物產品獸藥殘留檢測中的運用分析

王生華，康 平，熊永莉，洪維暉，伍 君，彭桂萍，雷 彬

（荊門市農產品質量檢驗所，湖北 荊門 448000）

1 QuEChERS 前處理技術運用

QuEChERS 前處理技術是近年來在國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術，因簡便、環保、低能耗、快速、安全可靠是當前樣品前處理的發展趨勢。樣品前處理是指樣品的制備、待測物的提取、凈化及濃縮等一系列過程。目前，動物樣品中獸藥殘留的前處理方法主要包括：基質固相分散萃?。∕SPD）、分散固相萃取技術（DSPE）、固相萃取法（SPE）、液液萃取法（LLE）、固相微萃?。⊿PME）與 QuEChERS 萃取法等。這些方法所用有機溶劑量大，用檢測人員和環境不太友好，我們想借助QuEChERS 前處理在農產品檢測中的優勢，實驗用于動物樣品的前處理，驗證是否實現優化動物樣品檢測方法的目的。

2 QuEChERS 前處理技術步驟

QuEChERS 前處理技術主要分為酸化乙腈的液液萃取過程和基質分散固相萃取凈化過程兩個步驟。該方法的研究熱點及難點是通過改進提取溶劑和凈化填料的組分，以取得最佳的提取和凈化效果。其主要步驟如圖1。

圖1

2.1 萃取過程

提取溶劑：為了準確地測定動物樣品中殘留獸藥的含量，合適的提取溶劑的選擇尤為關鍵。乙腈極性范圍較寬，組織穿透能力較強，對蛋白質、脂肪類化合物的提取率很低，對多數目標化合物有較好的溶解性和較高的提取效率；乙酸乙酯的極性相對較弱，毒性較低，二者均是較為理想的提取溶劑，加入一定體積分數的甲酸或者乙酸可以破壞基質的組織結構，目標物質在酸性環境下較易從組織結構中游離出來。

除水劑：提取溶劑除了能將待測物提取出來，同時也能提樣品中的水分，水分的存在使待測物部分溶于水中，與提取溶劑形成競爭關系，所以需要選擇合適的除水劑除去肌肉組織中的水分。常用除水劑有氯化鈉、無水硫酸鈉、硫酸鎂等，根據待測物的性質單獨使用或復配使用。氯化鈉通過分層來除水，無水硫酸鈉、硫酸鎂通過吸水除水；硫酸鈉吸水快，水容量大，容易失水，在干燥體系易形成動態平衡，使干燥難以徹底，故只可作為初步吸附；無水硫酸鎂吸附相對較慢，只能形成二結晶水，但吸附相對徹底，不適合用來吸附含水量較大的體系，且價格稍貴，不適合大批量使用。

2.2 凈化過程

樣品經提取溶劑、除水劑處理后，已經除去部分的脂肪、蛋白質以及水分等干擾物，提取溶劑除了能提取目標化合物和水分，同時也能提取樣品組織中的其他雜質，想要有效地除去雜質，同時不吸附目標化合物，凈化條件的選擇也顯得至關重要。QuEChERS 常用的凈化方式為：常用凈化劑、QuEChERS 凈化柱。

QuEChERS 方法中常用凈化劑：QuEChERS 的常用凈化劑包括：C18、PSA、GCB、酸性氧化鋁、硅藻土、-NH2凈化劑、中性氧化鋁；根據樣本和待測物的性質選用單用或復配。PSA 含有2個氨基，能有效吸附糖類、脂肪、色素和其他極性有機酸。C18 有十八烷基官能團，能吸附脂肪等非極性干擾物，C18E 為封尾的 C18 凈化劑填料，是疏水性較強的硅膠基體凈化劑，對非極性化合物具有出色的保留特性，對大多數有機物都有保留；GCB 對平面結構分子有很強的親和性，故能有效地去除色素和甾醇，同時也會吸附具有平面結構的獸藥。硅藻土有很強的吸油率，能有效地除去脂肪。

3 QuEChERS 前處理技術應用實例

隨著 QuEChERS 技術的不斷改良，該技術在檢測領域已普遍運用。我們以豬肉中磺胺藥物殘留檢測為例，用檢測機構常用的國標方法與QuEChERS 技術檢測方法進行比較，在QuEChERS 技術檢測方法中優化提取溶劑，確定除水劑及其用量，探究不同凈化劑的凈化效果，發現前處理過程操作簡單、耗時短、有機溶劑用量少、成本低，為動物產品中獸藥殘留檢測工作提供一定的參考。

QuEChERS 技術實驗過程：

3.1 前期準備

3.1.1 試樣制備

實驗用的豬肉樣品隨機購于各大商超市，樣品制備參照國標動物產品樣品處理方法。經均勻搗碎后，樣品分成兩份，分別裝入干凈自封袋內，一份作為試樣，一份作為留樣，保存于-20℃。

3.1.2 主要儀器（生產廠家僅為參考）（見表1）

表1

3.1.3 實驗試劑和耗材（生產廠家僅為參考） （見表2）

表2

3.1.4 標準物質（見表3）

表3

3.1.5 溶液配制方法

（1）0.1%甲酸乙腈溶液：0.1ml 甲酸溶于 99.9ml 乙腈。

（2）0.5%甲酸乙腈溶液：0.5ml 甲酸溶于 99.5ml 乙腈。

（3）乙腈飽和正己烷溶液：1：1 的乙腈與正己烷充分混合均勻，取上層待用。

（4）獸藥標準中間溶液：分別準確量取一定體積的獸藥標準儲備液用色譜純甲醇定容，混勻后制成濃度為10μg/ml 的標準中間液，-18℃條件下可存放 3 個月。

（5）獸藥標準工作液：準確量取一定量的獸藥標準中間溶液于容量瓶，用色譜純甲醇定容至刻度，配制成的 1μg/ml 標準工作液，現用現配。

3.1.6 標準曲線制作

溶劑標準曲線：準確量取適量標準工作液，用 20%的甲醇水（v/v）稀釋成 5、10、20、50、100、200ng/ml 的混合標準工作液，供LC-MS/MS 測定。

3.1.7 色譜條件

色譜柱：waters色 譜 柱（150mm×2.1mm，5μm）；柱溫：40℃；流速：0.4ml/min；進樣體積 5μL；流動相 A：0.1%甲酸水溶液，流動相 B：甲醇，梯度洗脫。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式，噴霧電壓：3500 V，掃描模式：多反應監測（MRM）。

（1）結果計算 樣品中各獸藥計算公式如下，計算結果需扣除空白值。

式中：

Xi——樣品中某一獸藥的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；ci——樣品制備液中獸藥的濃度，單位為納克每毫（ng/ml）；V——最終定容體積，單位為毫升（ml）；

2——稀釋倍數；

m——樣品質量，單位為克（g）。

（2）回收率計算 樣品中某一獸藥的回收率公式如下：

式中：

Ri——樣品中某一獸藥的回收率，單位為（%）；

Xi加標——某一獸藥加標后試樣測得的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

Xi——樣品中某一獸藥的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；Mi——某一獸藥實際加入樣品中的含量，單位為微克每千克（μg/kg）。

3.2 實驗方法

3.2.1 提取劑單因素實驗

以乙腈0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯作為單因素條件，將磺胺類獸藥在豬肉中加標濃度設為 100ng/ml，以回收率為衡量指標，考察上述提取液對磺胺常用4 種獸藥的提取效果。

試樣前處理

（1）提取

稱取陰性豬肉（是指已檢測未含有上述 4 種獸藥的豬肉）5 g（精確至 0.01g）肌肉組織于 50 ml 離心管中，加入 2 ml 乙腈飽和正己烷；加入 10 ml 不同提取溶劑（① 乙腈；② 0.1%甲酸乙腈；③ 乙酸乙酯），立即渦旋1min（2500rpm），充分混合均質，超聲 10 min，5000 r/min 離心 5 min。

（2）濃縮

準確移取5 ml 中間層提取液于氮吹管中，40℃氮吹至干，用 20%的甲醇水（v/v）定容至1 ml，渦旋，過 0.22μm 有機濾膜，供 LC-MS/MS 測定。

（3）測定

利用設置的色譜條件和質譜條件，將樣品溶液進行測定，外標法定量，定量離子采用豐度最大的二級特征離子碎片。

3.2.2 除水劑單因素實驗

（1）提取

稱取陰性豬肉 5g（精確至0.01g）肌肉組織于50 ml 離心管中，加入2ml乙腈飽和正己烷；加入10ml 0.5%甲酸乙腈，加蓋立即渦旋1min（2500rpm），充分混合均質，超聲10min。

（2）脫水（考察以下 2 種情況）

加入不同的除水劑，加蓋渦旋 1min（2500rpm），充分混合均質，超聲5min，5000r/min 離心5min；

① 2g 氯化鈉、2g 無水硫酸鈉、2g 無水硫酸鎂；② 硫酸鈉（2g、4g）；

③加1g無水硫酸鈉+1g無水硫酸鎂、加2g無水硫酸鈉+2g無水硫酸鎂

（3）濃縮

準確移取5ml 中間層提取液于氮吹管中，40℃氮吹至干，用 20%的甲醇水（v/v）定容至1ml，渦旋，過0.22μm 有機濾膜，供 LC-MS/MS 測定。

（4）測定

利用設置的色譜條件和質譜條件，將樣品溶液進行測定，外標法定量，定量離子采用豐度最大的二級特征離子碎片。

通過實驗結果證明，一是QuEChERS 方法和國家標準的檢測成本對比，QuEChERS 方法試劑成本65元，常規方法試劑成本212元，降低檢測成本為69.3%。二是檢測方法回收率同國標方法比對，QuEChERS 方法回收率能達到70%～95%，國標的方法結果在55%～90%。三是分析速度快，能在30min 內完成6個樣品的處理。四是溶劑使用量少，污染小，價格低廉。五是操作簡便，無需良好訓練和較高技能便可很好地完成。六是樣品制備過程中使用很少的玻璃器皿，裝置簡單。

QuEChERS 技術在動物產品檢測中不同程度存在受基質效應干擾樣品檢測分析問題，影響樣品的準確度、精密度、檢出限和定量限，也會因檢測過程中化學試劑含有毒有害物質，影響檢測人員身體健康等問題。在檢測操作中要充分評估各種風險，確保數據的準確性和可靠性。