乳酸脫氫酶同工酶檢測在神經母細胞瘤診療中的臨床價值*

張 偉，馬瑞敏，宋文琪，張國軍△

1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院實驗診斷中心/北京市免疫試劑臨床工程技術研究中心/國家藥品監督管理局體外診斷試劑質量控制重點實驗室，北京100070；2.國家兒童醫學中心/首都醫科大學附屬北京兒童醫院檢驗中心，北京 100045

神經母細胞瘤(NB)是發生于嬰幼兒時期的惡性實體瘤之一，約90%的患兒發病年齡<10歲[1]，NB在15歲以下兒童中的發病率約為 10.2/1 000 000[2]。NB是異質性較高的惡性腫瘤，以往診斷及治療效果評價主要依靠病理學及影像學檢查。盡管目前低、中危NB患兒可以獲得較長的存活期[3-5]，但約有50%的患兒初診時已處于高危階段，其長期生存率較低，5年無事件生存率<50%[6]。以往對NB患兒預后影響因素的研究主要涉及年齡、腫瘤轉移部位、乳酸脫氫酶(LDH)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、N-myc基因表達水平及組織學特征等。近年來隨著NB診療技術的不斷進步，兒童NB的預后也得到改善，對于其預后影響因素的研究也隨著治療方法的進步及治療水平的提高而發生改變[7]。以往患兒診治過程中只檢測LDH總活性，且關于LDH同工酶與NB關系的研究較少，基于此，本研究收集2019年2月至2022年2月首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心收治的NB患兒治療前及治療后不同階段的血清標本進行檢測，旨在探究LDH同工酶在NB診療中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年2月至2022年2月首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心收治的72例初診NB患兒為研究對象，其發病中位年齡為37個月，其中男38例，女34例。根據國際NB分期系統(INSS)[8]標準，本研究納入的72例患兒INSS分期Ⅰ期5例，Ⅱ期19例，Ⅲ 期14例，Ⅳ+Ⅳs期34例。依據美國兒童腫瘤協作組(COG)及歐洲危險度分組系統[9]，制訂首都醫科大學附屬北京兒童醫院NB危險度分組標準，根據患兒年齡、INSS分期、腫瘤轉移情況、病理類型、N-myc基因擴增情況，分為低危19例，中危12例，高危41例[10]。納入標準：(1)符合NB診斷標準[11]，且經腫瘤組織活檢或手術病理檢查證實為NB；(2)患兒按照NB診療方案系統化療并隨訪。排除標準：(1)未經過化療的患兒；(2)非因疾病進展而放棄治療的患兒；(3)治療前切除腫瘤的患兒。

1.2方法

1.2.1治療方案及療效評估 根據 BCH-NB-2007 化療方案，低/中危患兒給予4～6個療程化療，高危患兒給予7個療程化療。未行手術切除腫瘤的患兒在完成4個療程化療后于外科行腫瘤切除手術。治療結束后門診隨訪，隨訪截止日期為2022年2月28日。療效評價根據國際兒童實體瘤療效標準[12]，通過影像學檢查和骨髓活檢確定腫瘤大小和部位，評估治療效果。NB未進展/未復發：腫瘤穩定或完全消失，無新發病灶且無復發；NB進展/復發：原發病灶增大>25%或出現新發病灶。

1.2.2標本采集 收集患兒治療前及治療過程中各化療周期后48 h內的血清標本。具體采集方法：使用真空采血管采集患兒靜脈血，待自然凝固后以3 000 r/min離心10 min，分離血清，先將血清標本用于檢測LDH，隨后將血清標本分裝入凍存管，保存于-80 ℃冰箱，用于集中檢測LDH同工酶。

1.2.3檢測方法 LDH采用乳酸底物法，使用美國Beckman Coulter 公司AU5800全自動生化分析儀及配套原裝試劑進行檢測。LDH同工酶采用瓊脂糖凝膠電泳法，使用法國 Sebia公司HYDRASYS2全自動電泳儀及配套LDH同工酶檢測試劑盒進行檢測。LDH檢測過程中室內質控均在控，室內不精密度符合實驗室質量目標要求，室間質評結果為滿意。

1.2.4參考范圍 LDH參考范圍為110.0～295.0 U/L。LDH同工酶正常分布占比為LDH-1 26.2%～32.8%，LDH-2 34.0%～37.4%，LDH-3 17.9%～22.3%，LDH-4 6.8%～11.0%，LDH-5 4.7%～7.1%。LDH同工酶通過計算得出參考范圍為LDH-1 28.82～96.76 U/L，LDH-2 37.40～110.33 U/L，LDH-3 19.69～65.79 U/L，LDH-4 7.48～32.45 U/L，LDH-5 5.17～20.90 U/L[13]。檢測結果高于參考范圍者定義為陽性。

1.3統計學處理 采用SPSS26.0、MedCalc16.8軟件進行數據分析。計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗；非正態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；采用Spearman相關進行相關性分析；繪制受試者工作特征(ROC)曲線進行診斷效能評價。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NB患兒治療前LDH、LDH同工酶表達情況 72例NB患兒治療前 LDH、LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4、LHD-5水平分別為417.9(280.0,956.4)、123.4(83.6,232.7)、133.6(92.3,391.9)、73.4(51.9,193.1)、25.6(11.6,65.3)、38.4(21.7,61.8)U/L。治療前LDH-5陽性率為81.9%，高于LDH陽性率(66.7%),差異有統計學意義(P<0.05)；LDH-3陽性率為57.0%，LDH-4陽性率為38.9%，均低于LDH陽性率，差異均有統計學意義(P<0.05)；LDH-1陽性率為63.9%，LDH-2陽性率為59.7%，與LDH陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2NB進展/復發與未進展/未復發患兒治療前LDH同工酶水平比較 截至2022年2月28日，72例患兒中僅23例隨訪滿2年且未失訪，包括未進展/未復發16例(其中男7例，女9例，中位年齡44個月)、進展/復發7例(其中男4例，女3例，中位年齡32個月)。NB進展/復發與未進展/未復發患兒治療前LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，治療前LDH-1水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3治療前LDH、LDH同工酶單獨檢測及LDH-4、LDH-5聯合檢測預測NB進展/復發的效能 ROC曲線分析結果顯示，治療前LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5單獨檢測預測NB進展/復發的曲線下面積(AUC)高于LDH單獨檢測，而LDH-4、LDH-5聯合檢測的AUC高于各指標單獨檢測，見表2。

表1 NB進展/復發與未進展/未復發患兒治療前LDH同工酶水平比較[M(P25，P75)，U/L]

表2 治療前LDH、LDH同工酶單獨檢測及LDH-4、LDH-5聯合檢測預測NB進展/復發的效能

2.4治療前LDH、LDH同工酶水平與腫瘤大小的關系 治療前LDH及LDH同工酶水平與腫瘤最大徑均呈正相關(P<0.05)，見表3。

2.5治療過程中LDH同工酶占比變化 隨著治療的進行，LDH-1占比呈上升趨勢，LDH-4及LDH-5占比呈下降趨勢。治療前與第4次化療后LDH-1、LDH-4及LDH-5占比比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，LDH-2及LDH-3占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、圖2。

表3 治療前LDH、LDH同工酶水平與腫瘤最大徑的相關性分析結果

圖1 治療前及治療過程中LDH同工酶圖譜

圖2 治療前及治療過程中LDH同工酶占比變化

3 討 論

NB是兒童最常見的顱外惡性實體腫瘤，在我國占兒童惡性腫瘤的7%～10%。NB因臨床表現多樣，初期診斷困難，同時其進展快，預后差異較大，現階段主要根據影像學、病理學檢查及基因檢測結果對NB進行診斷和預后判斷[14]。近年來，兒童NB治療采用多學科聯合治療方案，但預后依然不佳，高危患兒長期存活率較低[15]。

LDH是對腫瘤有較高診斷價值的臨床指標，但LDH同工酶在指導腫瘤診治中的臨床意義仍有待深入研究。LDH有5種同工酶，每種都有不同的化學和物理特性。LDH同工酶可用于定位LDH的釋放源，LDH-5水平升高通常在肝臟疾病時出現，LDH-l水平升高通常提示心肌損傷，肝臟及心肌同時受損則LDH-1和LDH-5水平同時升高[16]。LDH在腫瘤疾病中的應用已有一定研究成果。JONG 等[17]發現，晚期非小細胞肺癌患者治療前LDH 水平升高及治療過程中 LDH 水平升高均與其總生存率較低顯著相關。還有研究發現，在進行免疫治療的轉移性結直腸癌患者中，LDH 水平較低的患者無進展生存時間明顯長于 LDH 水平較高的患者[18]。

以往NB患兒就診時僅常規檢測LDH水平，但多項研究發現，NB初診時LDH水平升高患兒比例并不高(53.8%～82.0%)，并且因為兒童處于生長發育階段，LDH活性明顯高于成人，如果采用成人的參考區間判別兒童LDH的檢測結果，有可能造成漏診[19-22]。本研究采用兒童的LDH參考區間，在72例NB患兒中，治療前LDH的陽性率為66.7%；此外，患兒LDH-5陽性率為81.9%，比LDH陽性率高(P<0.05)，表明LDH-5檢測可能較LDH檢測診斷NB的靈敏度更高。

腫瘤大小是患者療效評估的重要指標，陳琛君等[23]研究表明，NB患兒腫瘤最大徑>5 cm時LDH水平明顯增高；趙倩等[22]研究也表明，LDH是反映腫瘤負荷及代謝情況的指標之一。本研究分析了NB患兒治療前LDH、LDH同工酶水平與腫瘤大小的關系，結果顯示，LDH及LDH同工酶與腫瘤最大徑均呈正相關(P<0.05)，提示LDH、LDH同工酶水平越高，NB患兒腫瘤越大。動態分析治療過程中LDH同工酶的占比變化，結果顯示，隨著治療的進行，LDH-1占比呈上升趨勢，LDH-4及LDH-5占比呈下降趨勢；治療前與第4次化療后LDH-1、LDH-4及LDH-5占比比較，差異有統計學意義(P<0.05)，提示LDH同工酶檢測可在治療過程中作為療效評價的輔助手段。

近年國內已有研究分析了LDH與NB預后的關系，如蘇雁等[24]通過回顧性分析發現，初診時 LDH≥1 500 U/L 是影響NB患兒生存率的危險因素；張婷等[25]研究表明，LDH水平升高的NB Ⅳ期患兒總體預后較差。本研究的72例患兒中，由于收集樣本時間與隨訪截止時間相距較短，隨訪滿2年且無失訪者僅23例，其中7例患兒出現進展/復發，16例未進展/未復發。NB進展/復發患兒治療前LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5水平高于未進展/未復發患兒(P<0.05)，提示LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5可能與NB患兒的疾病進展/復發有關。進一步分析LDH、LDH同工酶對NB進展/復發的預測效能，結果顯示，治療前LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5單獨檢測預測NB進展/復發的AUC高于LDH單獨檢測，而LDH-4、LDH-5聯合檢測的AUC高于各指標單獨檢測，提示相較于LDH，LDH同工酶水平檢測更有助于早期判斷腫瘤進展/復發情況。

LDH發揮作用是Warburg效應的重要一環，與惡性腫瘤的增殖和侵襲密切相關[26]，Warburg效應是指惡性腫瘤細胞從有氧機制轉換到以無氧機制為主的現象，其中葡萄糖被轉換為乳酸。部分惡性腫瘤患者的血清LDH水平升高與其預后密切相關。研究表明，LDH-5是主要在癌細胞中過量表達的同工酶，而LDH-1在癌細胞與非癌細胞中的水平通常較低[27]。本研究LDH-4及LDH-5在NB患兒治療前占比較高，可能是由于LDH基因在腫瘤中對瘤內缺氧的反應導致的，而在治療后隨著瘤內缺氧的反應降低，LDH-4及LDH-5占比呈現出下降趨勢，LDH-1占比則在治療后隨著腫瘤的惡性程度減低逐漸升高。近年來，許多特異性抑制LDH-5活性的藥物已經在臨床進行測試[28]，可能有望為NB等有LDH-5活性升高特征的腫瘤患者提供新的治療方法。LDH-5活性的降低會導致線粒體呼吸的誘導、線粒體膜電位的降低和細胞內氧化應激反應水平的升高，而這些變化會干擾腫瘤細胞的增殖能力，降低其轉移能力，并增加其對化療藥物的敏感性[29-30]。

綜上所述，相較于單獨檢測LDH，LDH同工酶檢測更有助于提高對NB進展/復發的預測價值，在治療期間監測LDH同工酶水平還有助于判斷治療效果及預測預后。但因本研究納入樣本量有限，研究結果還需要增加樣本量及進行多中心研究以進一步驗證。