lncRNA TTN-AS1調控miR-134-5p/MBTD1信號軸促進骨肉瘤的生長和轉移*

劉漢濤，秦宏敏，趙良虎

攀枝花學院附屬醫院骨科，四川攀枝花 617000

骨肉瘤是一類多發生于兒童、青少年的原發性骨惡性腫瘤，轉移性或復發性的骨肉瘤患者5年生存率低于30%，目前骨肉瘤的治療方式包括手術治療和化療等，但是手術后復發或化療耐藥一直威脅著患者的健康，所以尋找新型的骨肉瘤治療方法尤為重要[1-2]。長鏈非編碼 RNA(lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼 RNA，可通過表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平影響基因表達和翻譯，進而參與調控腫瘤生長[3-4]。其中TTN-AS1已經被證實是在多種腫瘤中發揮調控作用的一種lncRNA，過表達的TTN-AS1與乳腺癌、肺癌、消化系統腫瘤、生殖系統腫瘤患者的不良預后相關[5]。本文通過探究TTN-AS1在骨肉瘤中的表達及其對骨肉瘤細胞生長和轉移的影響與相關機制，旨在為骨肉瘤的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料來源 人成骨細胞hFoB1.19和人骨肉瘤細胞U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2購自中國科學院上海細胞庫。

1.2儀器與試劑 反轉錄試劑盒為日本TaKaRa公司產品；PowerUpTMSYBR?Green Master Mix 試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒和Trizol試劑盒為美國Invitrogen公司產品；細胞計數試劑盒(CCK8法)為沈陽萬類生物技術有限公司產品；雙熒光素酶報告基因試劑盒為美國Promega公司產品。含MBT結構域蛋白1(MBTD1)質粒、TTN-AS1小干擾RNA(siRNA)、TTN-AS1 siRNA 陰性對照、微小RNA(miR)-134-5p inhibitor為上海吉瑪制藥技術有限公司產品。miR-134-5p、TTN-AS1、MBTD1、GADPH、U6引物序列由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細胞培養 取液氮保存的hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2細胞，迅速解凍后1 000 r/min離心5 min，細胞沉淀溶解于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中，隔天更換培養基，細胞培養至匯合度達80%時進行細胞傳代。

1.3.2細胞分組與轉染 對hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2細胞中TTN-AS1的表達水平進行檢測，選擇表達水平最高的SAOS2細胞進行后續研究。將SAOS2細胞分為Control組(未轉染)、si-NC組(轉染TTN-AS1 siRNA 陰性對照)、si-TTN-AS1組(轉染TTN-AS1 siRNA)、si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor組(共轉染TTN-AS1 siRNA和miR-134-5p inhibitor)、si-TTN-AS1+MBTD1組(共轉染TTN-AS1 siRNA和MBTD1質粒)，按照上述分組使用Lipofectamine 2000試劑盒進行轉染。主要步驟：轉染前1 d采用6孔板接種5×105個SAOS2細胞，將1 μg/50 μL的A液[TTN-AS1 siRNA 陰性對照或TTN-AS1 siRNA或miR-134-5p inhibitor或MBTD1質粒(不含血清Opti-MEM培養基)]與1 μg/50 μL的B液[Lipofectamine 2000試劑(不含血清Opti-MEM培養基)]混勻，室溫放置20 min，將培養基更換為無血清的DMEM培養基，按實驗分組分別加入相應的混合液，37 ℃孵育6 h，再換成含10%FBS的DMEM培養基培養24 h。

1.3.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-134-5p、MBTD1 mRNA與TTN-AS1表達水平 采用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，核酸定量后將RNA稀釋為1 μg/μL，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，反應體系：RNA 2 μL，Oligo(dT) Primer 1.5 μL，Random 6 mers 1.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.5 μL，5×PrimeScript Buffer 6 μL，RNase-free dH2O 7.5 μL；反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存反應產物。所得cDNA使用qRT-PCR試劑盒檢測miR-134-5p、MBTD1 mRNA與TTN-AS1表達水平，反應體系：PowerUpTMSYBR?Green Master Mix(2×)10 μL,上游引物0.6 μL,下游引物0.6 μL,DNA模板1 μL,RNase-free dH2O 7.8 μL；反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環,無最后延伸。引物序列：TTN-AS1上游引物5′-CCAGACACCTAACCAACTTCC-3′，下游引物5′-GTGATCTCATCCCTCTTGCTT-3′；MBTD1上游引物5′-CTACAGCCTCCAGCATCACA-3′，下游引物5′-CTCATCAGCTGACCC AGACA-3′；GADPH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-TGGTGAAG ACGCCAGTGGA-3′；miR-134-5p上游引物5′-CTCAACAACCTTGGCTGACCG-3′，下游引物5′-ACACTATGTGTCGAAGCTT-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采集熒光信號Ct值,以GAPDH或U6作為內參，用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

1.3.4雙熒光素酶報告基因實驗 采用StarBase數據庫預測TTN-AS1和miR-134-5p的結合位點，TargetScan數據庫預測MBTD1和miR-134-5p的結合位點，使用Lipofectamine 2000試劑盒將含TTN-AS1 WT、TTN-AS1 MUT、MBTD1 WT、MBTD1 MUT熒光素酶載體轉染至SAOS2細胞，然后再分別將miR-NC和miR-134-5p mimic轉染至上述轉染的SAOS2細胞(miR-NC+TTN-AS1 WT組、miR-NC+TTN-AS1 MUT組、miR-134-5p mimic+TTN-AS1 WT組、miR-134-5p mimic+TTN-AS1 MUT組、miR-NC+MBTD1 WT組、miR-NC+MBTD1 MUT組、miR-134-5p mimic+MBTD1 WT組、miR-134-5p mimic+MBTD1 MUT組)。轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組細胞相對熒光強度。

1.3.5CCK8法檢測細胞增殖 將各組細胞按照每孔5×103個接種于96孔板中，每組5個復孔，設置培養24、48、72 h的細胞培養板，在對應的時間點取出96孔板，每孔加入10 μL 5 mg/mL的CCK8溶液，在37 ℃培養箱中孵育4 h后用酶標儀檢測450 nm處每孔的吸光度(A)值。

1.3.6Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲 將各組細胞用不含血清的DMEM溶液重懸后，以1×104個/孔的濃度接種于Transwell上室(或以1×104個/孔的濃度接種于鋪有50 μL Matrigel膠的Transwell上室用于檢測細胞侵襲能力)，小室置于含DMEM培養基(含10%FBS)的24孔板中，小室底部浸于培養基中，72 h后取出小室，用棉簽擦除上室中未穿過的細胞，小室底部用多聚甲醛固定10 min，然后用結晶紫染色10 min，清洗晾干后于顯微鏡下觀察拍照，使用Image J軟件統計細胞遷移或侵襲數。

2 結 果

2.1TTN-AS1在人成骨細胞及骨肉瘤細胞中的表達水平 與人成骨細胞hFoB1.19比較，骨肉瘤細胞U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2中TTN-AS1表達水平明顯上調(P<0.05)，其中SAOS2細胞中TTN-AS1表達水平最高，因此選擇SAOS2細胞進行后續研究，見圖1。

注：與hFoB1.19細胞比較，*P<0.05。圖1 TTN-AS1在hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2細胞中的表達水平

2.2TTN-AS1靶向調控miR-134-5p StarBase數據庫預測TTN-AS1和miR-134-5p的結合位點如圖2A所示。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC+TTN-AS1 WT組比較，miR-134-5p mimic+TTN-AS1 WT組的SAOS2細胞相對熒光強度明顯下調(P<0.05)，而miR-NC+TTN-AS1 MUT組的SAOS2細胞相對熒光強度與miR-134-5p mimic+TTN-AS1 MUT組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。qRT-PCR檢測結果顯示，si-TTN-AS1組SAOS2細胞miR-134-5p表達水平明顯高于si-NC組(P<0.05)，見圖2C。

2.3miR-134-5p靶向調控MBTD1 TargetScan數據庫預測MBTD1和miR-134-5p的結合位點如圖3A所示。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC+MBTD1 WT組比較，miR-134-5p mimic+MBTD1 WT組的SAOS2細胞相對熒光強度明顯下調(P<0.05)，而miR-134-5p mimic+MBTD1 MUT組和miR-NC+MBTD1 MUT組的SAOS2細胞相對熒光強度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3B。

注：A為StarBase數據庫預測TTN-AS1和miR-134-5p的結合位點；B為雙熒光素酶報告基因實驗驗證TTN-AS1與miR-134-5p的靶向關系，與miR-NC+TTN-AS1 WT組比較，*P<0.05；C為qRT-PCR檢測TTN-AS1對miR-134-5p表達的影響，與si-NC組比較，#P<0.05。圖2 TTN-AS1靶向調控miR-134-5p

2.4TTN-AS1通過調控miR-134-5p/MBTD1信號軸調控骨肉瘤細胞的增殖 Control組與si-NC組細胞MBTD1 mRNA表達水平及增殖能力(即培養24、48、72 h時細胞的A值)差異無統計學意義(P>0.05)。與si-NC組比較，si-TTN-AS1組細胞MBTD1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，細胞增殖能力明顯下降(P<0.05)；與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+MBTD1組細胞MBTD1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)，見圖4。

2.5TTN-AS1通過調控miR-134-5p/MBTD1信號軸調控骨肉瘤細胞的遷移和侵襲 Control組與si-NC組細胞遷移和侵襲能力差異無統計學意義(P>0.05)。與si-NC組比較，si-TTN-AS1組細胞遷移和侵襲能力明顯下降(P<0.05)；與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+MBTD1組細胞遷移和侵襲能力明顯增強(P<0.05)，見圖5。

注：A為TargetScan數據庫預測MBTD1和miR-134-5p的結合位點；B為雙熒光素酶報告基因實驗驗證MBTD1和miR-134-5p的靶向關系，與miR-NC+MBTD1 WT組比較，*P<0.05。圖3 miR-134-5p靶向調控MBTD1

注：A為qRT-PCR檢測各組細胞MBTD1 mRNA表達水平；B為CCK8法檢測各組細胞增殖能力；與si-NC組比較，*P<0.05；與si-TTN-AS1組比較，#P<0.05。圖4 TTN-AS1通過調控miR-134-5p/MBTD1信號軸調控骨肉瘤細胞的增殖

注：A為Transwell小室法檢測各組細胞遷移和侵襲能力鏡下圖(×20)；B為Transwell小室法檢測各組細胞遷移和侵襲數；與si-NC組比較，*P<0.05；與si-TTN-AS1組比較，#P<0.05。圖5 TTN-AS1通過調控miR-134-5p/MBTD1信號軸調控骨肉瘤細胞的遷移和侵襲

3 討 論

隨著基因測序和基因芯片技術的發展，越來越多的lncRNA被發現可調控腫瘤的發生、發展以及與患者的預后相關，也有研究指出，lncRNA有望成為腫瘤治療的新靶點[6-7]。骨肉瘤是一種原發性骨惡性腫瘤，腫瘤的迅速增殖以及轉移是影響骨肉瘤預后的重要因素，雖然隨著手術和放化療等治療方式的聯合使用，骨肉瘤患者的生存時間顯著延長，但是耐藥、復發、轉移等仍嚴重影響著患者的臨床治療效果。研究表明，多種lncRNA均可調控骨肉瘤的病理進程，例如SNHG4通過靶向調控miR-224-3p促進骨肉瘤的生長并且與患者的不良預后相關[8]，其也可通過調控miR-377-3p的表達而促進骨肉瘤的增殖和遷移[9]；SARCC可調控miR-143/己糖激酶2信號軸而影響骨肉瘤對順鉑的敏感性[10]；DANCR可靶向調控miR-149/MSI2軸而促進骨肉瘤的遷移和侵襲能力[11]。有研究亦發現多種lncRNA具有抑制骨肉瘤的功能，例如TMPO-AS1可靶向調控miR-329和E2F1基因而促進骨肉瘤細胞的凋亡[12]；TUSC7可通過miR-181a/RASSF6軸抑制骨肉瘤的進展[13]。所以，lncRNA被認為具有作為腫瘤治療靶點的潛力。

TTN-AS1已經被發現在多種腫瘤中發揮重要的調控作用。有研究指出，TTN-AS1可通過調控miR-376a-3p而促進子宮內膜癌的病理進程[14]；TTN-AS1也可通過靶向調控miR-27b-3p/RUNX1軸而促進膠質瘤的病理進程[15]；其亦可通過調控miR-15b-5p/FBXW7軸而促進卵巢癌的生長和轉移[16]。但是目前關于TTN-AS1在骨肉瘤中的表達研究較少，本研究發現，TTN-AS1在骨肉瘤細胞U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2中的表達水平明顯高于在人成骨細胞hFoB1.19中的表達水平，推測TTN-AS1具有調控骨肉瘤細胞生長和轉移的功能。本研究在TTN-AS1表達水平最高的SAOS2細胞中轉染TTN-AS1 siRNA抑制TTN-AS1表達后，SAOS2細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著降低，說明抑制TTN-AS1表達可抑制骨肉瘤細胞的生長和轉移。lncRNA的重要調控機制為抑制miRNA表達而影響其靶基因的表達，在腫瘤的病理進程中，lncRNA會攜帶其miRNA的“種子序列”，像海綿一樣結合于miRNA，進而抑制miRNA與mRNA的結合[17-18]。本文通過生物信息學預測TTN-AS1和miR-134-5p的結合位點，并且通過雙熒光素酶報告基因實驗證明miR-134-5p為TTN-AS1的靶基因。miR-134-5p亦在多種腫瘤中發揮調控作用，例如miR-134-5p靶向DAB2促進Ⅰ期肺腺癌的轉移和化療耐藥[19]。也有研究表明，miR-134-5p可被多種lncRNA調控而影響腫瘤的病理進程，例如LINC01278通過調控miR-134-5p/KDM2A軸而加速腸癌的病理進程[20]，LINC00858通過調控miR-134-5p/RAD18信號通路而加重卵巢癌細胞的癌癥表型[21]。本研究發現，抑制TTN-AS1可促進SAOS2細胞miR-134-5p的表達。共轉染TTN-AS1 siRNA和miR-134-5p inhibitor后的SAOS2細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯強于轉染TTN-AS1 siRNA的SAOS2細胞，說明TTN-AS1可通過調控miR-134-5p的表達水平而影響骨肉瘤細胞的生長和轉移。

miRNA發揮調控作用的機制為結合于其靶基因mRNA的3′非翻譯區而抑制靶基因的蛋白質翻譯[22]。本文通過TargetScan數據庫預測miR-134-5p與MBTD1的結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗驗證了MBTD1為miR-134-5p的靶基因。MBTD1是與腫瘤發生相關的多克隆蛋白家族成員[23-24]，研究表明，過表達MBTD1與前列腺癌的不良預后相關[25]；HAN等[26]發現，在子宮內膜間質肉瘤中存在的MBTD1-PHF1基因融合與疾病的發生密切相關。

綜上所述，lncRNA TTN-AS1在骨肉瘤中高表達，抑制其表達可顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能與TTN-AS1調控miR-134-5p/MBTD1信號軸有關，但本研究僅為體外研究，體內研究是否會得到相同的結果尚需深入探討，特別是TTN-AS1能否作為骨肉瘤診斷標志物或治療靶點還需進一步研究。