整聯蛋白α5β1通過介導Gli1表達影響基底細胞癌的生長與放療敏感性*

李錦意，黃小輝，范國雄

廣東省惠州市第三人民醫院皮膚科，廣東惠州 516000

基底細胞癌(BCC)起源于表皮的最內層或毛囊外根鞘，屬于源自基底細胞的常見惡性上皮腫瘤之一[1-2]。性別、年齡、紫外線輻射情況、吸煙史等都是BCC形成的影響因素[3]。BCC起病較為隱匿，因而易發生漏診，其治療后復發也極為常見。目前，藥物和手術治療BCC的效果欠佳[4]。放療在手術耐受能力差且年齡較大的BCC患者中被廣泛使用，然而，隨著腫瘤細胞對放療抵抗性的產生，需要增大照射劑量，但這一操作將會對正常組織造成嚴重損傷。整聯蛋白又稱為整合素，是一類黏附分子，屬于異源二聚體跨膜糖蛋白，可介導細胞-細胞和細胞-細胞環境之間的相互作用，在多種類型的細胞中廣泛表達，主要包括腫瘤細胞、內皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞等[5]。整聯蛋白α5β1作為整聯蛋白家族的重要成員之一，由β1和α5亞基的二聚化形成，已知其在多種腫瘤中高表達，并參與調控腫瘤細胞生長、黏附、侵襲、遷移及腫瘤血管生成[6-7]。Gli家族鋅指蛋白1(Gli1)是Hedgehog(Hh)信號通路遠端的效應轉錄因子，Hh信號通路是多種生物學過程的重要介質，包括胚胎發生、成體組織穩態及腫瘤發生、發展。研究表明，Gli1的異常激活與多種惡性腫瘤的發生有關，例如乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌及子宮內膜癌的發生等[8-9]?；诖?，本研究檢測了α5β1在BCC中的表達情況，并探究其對腫瘤細胞生長與放療敏感性的影響及相關分子機制，旨在為以α5β1為靶點的BCC治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月本院皮膚科門診收治的32例BBC患者的皮膚BBC組織標本為研究對象，標本來源患者均經臨床和病理檢查確診，其中男20例，女12例；年齡38～69歲，平均(51.40±5.16)歲。以同期32例行非腫瘤性皮瓣移植手術患者的正常皮膚組織標本作為對照。對照標本來源患者中男17例，女15例；年齡40～68歲，平均(54.35±5.32)歲。所有患者術前均未經放療、光動力及其他手段治療，并已排除合并其他類型腫瘤。所有患者對本研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 A431細胞購于中國科學院基礎醫學研究所，Gli1抑制劑GANT61購于英國Abcam公司，胎牛血清、DMEM培養基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，免疫組織化學染色試劑盒購于江蘇凱基生物有限公司，RNAiso Plus試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒和增強化學發光法(ECL)發光液購于碧云天生物技術研究所，聚偏氟乙烯(PVDF)膜和Transwell小室購于美國BD公司，MTT試劑盒、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒及Hoechst 33258細胞凋亡染色試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，兔抗α5β1多克隆抗體、兔抗Gli1多克隆抗體、鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購于英國Abcam公司。重組慢病毒載體pLEX-MCS與pLEX-α5β1的構建、包裝及滴度測定均由豐暉生物科技有限公司完成。其他實驗試劑均為國產分析純。BB150-2TCS型細胞培養箱購于美國Thermo Fisher Scientific公司，CX43型光學顯微鏡購于日本Olympus公司，C1Si型激光共聚焦顯微鏡購于日本Nikon公司，XSZ-220/20型X線深部治療機購于丹東市康佳醫用機廠，iMark型酶標儀購于美國Bio-Rad公司，DYY-16D型電泳系統購于北京六一儀器廠，FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀購于美國BD公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學染色 將皮膚BBC組織及正常皮膚組織標本在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。切片脫蠟，加入檸檬酸緩沖液煮沸，在3%H2O2溶液中消除內源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉。滴加兔抗α5β1多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加HRP標記二抗(1∶1 000)，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，反復沖洗，脫水透明，中性樹膠封片，干燥。通過光學顯微鏡觀察染色情況并攝取圖片，α5β1陽性表達多呈棕黃色至棕褐色，隨機選擇5個視野，結果根據陽性細胞率與染色強度進行綜合評定。陽性細胞率評分：<5%記0分，5%～25%記1分，>25%～50%記2分，>50%～75%記3分，>75%記4分。染色強度評分：未著色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。兩者分數相加<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.3.2細胞培養與轉染 取A431細胞隨機分為對照A組、pLEX-MCS組、pLEX-α5β1組、pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組。在各組A431細胞中添加含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中過夜培養。調整細胞水平為4×105/mL，取100 μL接種于6孔板，分別將含pLEX-MCS和pLEX-α5β1的慢病毒液加入對應組的細胞孔內進行轉染，病毒轉染復數(MOI)設為50∶1。pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組細胞在轉染時添加100 μmol/L Gli1抑制劑GANT61。轉染培養4 h，收集細胞，換用新鮮培養液，添加1 mg/L嘌呤霉素進行篩選，獲得穩定表達α5β1的A431細胞系。

1.3.3實時熒光定量PCR 采用RNAiso Plus試劑盒提取轉染后的A431細胞總RNA，測定RNA純度與濃度。將RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行擴增，反應條件：95 ℃ 3 min，1個循環；95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45個循環。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算α5β1和Gli1的mRNA表達水平。α5β1上游引物：5′-CATCTTGGCATGCGCTCCA-3′，下游引物：5′-GTCTTGGTGAACTCGGCACT-3′；Gli1上游引物：5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′，下游引物：5′-GCCAGGGACACCTCCA-3′；β-actin上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4蛋白質免疫印跡法(Western blot) 收集轉染后的A431細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，在梳孔加入標本，電泳分離蛋白，轉膜、封閉，TBST緩沖液洗膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜，次日TBST緩沖液再洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h，ECL發光液顯色，凝膠成像系統掃描成像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析目的蛋白α5β1、Gli1蛋白表達水平。

1.3.5MTT法 收集轉染后的A431細胞，每孔中加入20 μL MTT混勻，繼續培養4 h，再加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床振蕩至結晶物完全溶解，酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度(A)值，計算各組細胞存活率=各組A值/對照孔A值×100%。

1.3.6EdU染色 收集轉染后的A431細胞，調整水平后以1×105個/孔接種于24孔板，加入10 μmol/L EdU進行染色處理，PBS清洗，再用Apollo567避光孵育30 min，DAPI染料染核，洗滌后封片，干燥，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況并攝取圖片，紅色熒光為EdU陽性細胞的細胞核，隨機選擇5個視野，計數該視野下EdU陽性細胞數與總細胞數，兩者比值為EdU陽性細胞率。

1.3.7Hoechst 33258染色 收集轉染后的A431細胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，加入200 μL Hoechst 33258染色液，室溫避光孵育10 min，PBS再次清洗，滴加抗熒光猝滅劑封片，干燥，通過熒光顯微鏡觀察各組細胞凋亡情況并攝取圖片，細胞核呈藍色，熒光濃染顆粒為凋亡細胞。

1.3.8Transwell實驗 將Matrigel膠鋪于24孔Transwell上室底部，置于37 ℃培養箱內凝膠。將轉染后的A431細胞水平調整為2×104/mL，吸取200 μL移入Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的新鮮培養液，培養24 h后用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，PBS清洗，通過光學顯微鏡觀察并拍攝圖像，隨機選擇5個視野計數侵襲細胞數。細胞遷移檢測時在Transwell上室不鋪Matrigel膠，其余步驟均與上述步驟相同。

1.3.9細胞分組與放療處理 取A431細胞隨機分為對照B組、4 Gy組、pLEX-α5β1+4 Gy組。對照B組細胞正常培養，4 Gy組細胞進行4 Gy X射線照射，pLEX-α5β1+4 Gy組細胞進行轉染pLEX-α5β1慢病毒處理后采用4 Gy X射線照射。將細胞按照5×104個/孔接種于6孔板，采用4 Gy X射線照射(6 mV射線垂直照射，劑量率為200 cGy/min，源皮距為100 cm)。在處理后培養24、48、72 h時采用MTT法檢測各組細胞增殖活性A值。

1.3.10流式細胞術 收集經放療處理后的A431細胞，PBS清洗，胰酶消化，離心后用PBS將沉淀重懸于100 μL染料結合緩沖液中，調整細胞水平為1×106/mL，取100 μL懸液移入干凈離心管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，渦旋混勻，室溫避光靜置20 min，隨后立即通過流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

2 結 果

2.1皮膚BBC組織及正常皮膚組織α5β1表達情況比較 相較于正常皮膚組織，皮膚BBC組織內有大量區域染色呈棕黃色至棕褐色，見圖1；皮膚BBC組織α5β1陽性表達率為84.38%(27/32)，明顯高于正常皮膚組織的α5β1陽性表達率[12.50%(4/32)]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2各組A431細胞中α5β1與Gli1表達情況比較 與對照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組細胞中α5β1 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)；pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組α5β1 mRNA和蛋白表達水平與pLEX-α5β1組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2A、2B。pLEX-α5β1組細胞中Gli1 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于對照A組和pLEX-MCS組(P<0.05)；而與pLEX-α5β1組比較，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組Gli1 mRNA和蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)，見圖2C、2D。

注：A為正常皮膚組織；B為皮膚BBC組織。圖1 免疫組織化學染色檢測皮膚BBC組織及正常皮膚組織中α5β1的表達(×200)

注：A為實時熒光定量PCR檢測的各組A431細胞中α5β1 mRNA表達水平比較；B為Western blot檢測的各組A431細胞中α5β1蛋白條帶圖及表達水平比較；C為實時熒光定量PCR檢測的各組A431細胞中Gli1 mRNA表達水平比較；D為Western blot檢測的各組A431細胞中Gli1蛋白條帶圖及表達水平比較；與對照A組比較，*P<0.05；與pLEX-MCS組比較，#P<0.05；與pLEX-α5β1組比較，△P<0.05。圖2 各組A431細胞中α5β1與Gli1表達情況比較

2.3各組A431細胞增殖能力比較 MTT法檢測結果顯示，與對照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組細胞存活率明顯升高(P<0.05)；與pLEX-α5β1組比較，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組細胞存活率明顯降低(P<0.05)，見圖3A。EdU染色結果顯示，與對照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組EdU陽性細胞率明顯升高(P<0.05)；與pLEX-α5β1組比較，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組EdU陽性細胞率明顯降低(P<0.05)，見圖3B、3C。

2.4各組A431細胞凋亡形態檢測結果 Hoechst 33258染色結果顯示，對照A組和pLEX-MCS組細胞內均出現較明顯的細胞核濃縮，可見深色熒光濃染顆粒，偶見細胞核碎裂；而pLEX-α5β1組細胞內染色均勻，細胞核和細胞質未發生濃縮；相較于pLEX-α5β1組，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組有細胞發生細胞核濃縮現象，呈深色熒光濃染，見圖4。

2.5各組A431細胞遷移與侵襲能力比較 Transwell實驗結果顯示，與對照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組遷移細胞數與侵襲細胞數均明顯增加(P<0.05)；而相較于pLEX-α5β1組，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組遷移細胞數與侵襲細胞數均明顯減少(P<0.05)，見圖5。

注：A為MTT法檢測的各組A431細胞存活率比較；B為各組A431細胞中EdU陽性細胞率比較；C為EdU染色檢測各組A431細胞增殖活性圖(×100)；與對照A組比較，*P<0.05；與pLEX-MCS組比較，#P<0.05；與pLEX-α5β1組比較，△P<0.05。圖3 各組A431細胞增殖能力檢測結果

圖4 Hoechst 33258染色下各組A431細胞凋亡形態(×200)

2.6A431細胞對放療的敏感性 MTT法檢測各組A431細胞增殖活性變化，結果顯示，在處理后培養24、48和72 h時，與對照B組比較，4 Gy組細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)；而pLEX-α5β1+4 Gy組細胞增殖活性較4 Gy組明顯升高(P<0.05)，見表1。流式細胞術檢測放療處理后細胞凋亡情況，結果顯示，4 Gy組細胞凋亡率較對照B組明顯升高(P<0.05)；pLEX-α5β1+4 Gy組細胞凋亡率較4 Gy組明顯降低(P<0.05)，見圖6。

表1 不同培養時間各組A431細胞增殖活性A值比較

注：A為顯微鏡下各組遷移細胞與侵襲細胞圖(×100)；B為各組遷移細胞數比較；C為各組侵襲細胞數比較；與對照A組比較，*P<0.05；與pLEX-MCS組比較，#P<0.05；與pLEX-α5β1組比較，△P<0.05。圖5 Transwell實驗檢測各組A431細胞的遷移與侵襲能力

注：A為各組流式細胞術檢測結果；B為各組細胞凋亡率比較；與對照B組比較，*P<0.05；與4 Gy組比較，#P<0.05。圖6 流式細胞術檢測各組A431細胞凋亡情況

3 討 論

據報道，全球BCC的發病率在不斷增加，我國約70%的皮膚腫瘤為BCC[2]。BCC的治療方式可分為局部治療和全身治療，其中局部治療包括手術治療、冷凍療法、激光及藥物治療等，全身治療包括使用化療藥物維莫德吉、索尼德吉等在內的方法。此外，光動力治療和基因治療目前也被應用到BCC的臨床治療中或已開展了大量的實驗研究[10]。雖然大多數早期BCC屬于低度惡性腫瘤，只發生局部病變且易于治療，但晚期BCC的治療方法仍然十分有限。目前，晚期BCC(包括轉移性BCC和局部難治性BCC)治療難度大，治療后5年復發率達20%，且患者預后不佳。因此，進一步探索BCC的發病機制及與其發生相關的潛在生物標志物，并以此來尋找BCC治療的新型方案，是目前臨床研究的熱點及重點。

整聯蛋白由兩個亞基組成，其中α亞基相對分子質量為(120～170)×103，β亞基相對分子質量為(90～100)×103。人體內共有18個α亞基和8個β亞基，可以組裝成至少24種具有不同結合特性、組織分布和生物學功能的αβ整聯蛋白異二聚體，來充當組織和器官特異性配體的受體。在這24種整聯蛋白亞型中，已發現多種亞型與腫瘤血管生成，腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲有關，并參與調控腫瘤細胞對化療和放療的敏感性[6,11]。α5β1是唯一已知的α5整聯蛋白，作為跨膜蛋白其具有不同的結構域，包括決定α5β1多種功能的細胞外結構域、跨膜結構域和細胞質結構域。細胞外和跨膜結構域負責與細胞外基質蛋白或其他細胞外配體結合，并有助于后續相關信號通路的功能發揮，而細胞質結構域可以與細胞骨架相關蛋白相互作用以影響細胞遷移、侵襲和增殖。已有報道指出，α5β1與癌細胞的失巢凋亡抗性或藥物抗性有關[12-13]；此外，α5β1還與骨組織形成的維持和致動脈粥樣硬化炎癥的發生有關[14-15]。α5β1的多種功能表明其表達失調可能導致包括癌癥在內的多種疾病，目前研究已證實α5β1過表達可促進一些腫瘤的生長與轉移，如MITRA等[16]研究表明，纖連蛋白與α5β1的結合導致了α5整聯蛋白與c-Met直接結合(c-Met位于Src和FAK的上游)，α5β1通過該作用激活c-Met/FAK/Src依賴性信號通路，從而促進卵巢癌細胞的侵襲和轉移；MOROZEVICH等[17]研究發現，在MCF-7人乳腺癌細胞中，α5β1的高表達通過增強絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)的活性來促進乳腺癌細胞侵襲及對多柔比星的抗性。本研究中，α5β1在皮膚BCC組織中異常表達，皮膚BBC組織α5β1陽性表達率明顯高于正常皮膚組織(P<0.05)，進一步通過體外實驗發現，A431細胞過表達α5β1后，細胞的增殖、遷移與侵襲能力均提高，并抑制了細胞凋亡的發生。

放療抵抗是腫瘤復發的主要原因之一，細胞與細胞外基質成分的黏附性是腫瘤化療與放療反應性的決定因素。目前，已有關于α5β1作為介導腫瘤放療敏感性的重要調節因子的報道，如DAMIANO等[18]在研究中指出，α5β1可促進K562慢性粒細胞白血病細胞與纖連蛋白結合，這種結合作用對化療藥物和γ輻射誘導的細胞凋亡均表現出一定的抵抗力；SHABANA等[19]研究表明，α5β1在膠質母細胞瘤中過表達，PR_b是一種特異性靶向α5β1的纖連蛋白模擬肽，而含微小RNA(miR)-603的PR_b修飾的脂質體復合物能夠明顯增強膠質母細胞瘤干細胞對電離輻射的敏感性，這意味著α5β1的高表達可能影響了腫瘤細胞對放療的敏感性。本研究結果顯示，α5β1在A431細胞中高表達降低了細胞對4 Gy X射線照射的敏感性，因此，靶向α5β1可能是提高腫瘤細胞放療敏感性的有效方法之一。

α5β1作為細胞表面受體發揮作用，能夠激活導致腫瘤發生及進展的關鍵信號通路。以往研究表明，Hh信號通路可能與BCC的進展有關，也是BCC發病機制啟動的關鍵通路，Hh信號通路的異常激活導致驅動BCC發生的靶基因的組成型激活，其中包括Gli1[20-21]。BRENNAN-CRISPI等[22]報道指出，在痣樣基底細胞癌小鼠模型中橋粒鈣黏蛋白2(Dsg2)過表達，以自分泌和旁分泌方式誘導轉錄激活因子3(Stat3)磷酸化并增加Gli1的表達水平，從而促進痣樣基底細胞癌發展。在本研究中，A431細胞高表達α5β1后其細胞內Gli1 mRNA、蛋白的表達水平也明顯升高。GANT61是一種可滲透細胞的六氫嘧啶化合物，是Gli介導的基因反式激活的抑制劑，其已被證明在腫瘤細胞中具有抑制細胞生長和抗腫瘤干細胞活性的作用[23]。本研究使用Gli1抑制劑GANT61進行處理后，A431細胞增殖、遷移與侵襲能力均顯著下降，由此推測，α5β1促進BCC細胞生長的生物學作用可能與其介導的Gli1表達水平升高相關。

綜上所述，α5β1在BCC中異常高表達，其高表達可提高BCC細胞增殖活性，促進BCC細胞的遷移與侵襲，并降低其對放療的敏感性，該作用可能是通過介導Gli1表達來實現的。因此，以整聯蛋白α5β1為靶點治療BCC可能是一種潛在策略，但α5β1是否通過轉錄后水平直接調控Gli1的表達，有待后續進行相關研究證實。