激活蛋白-1家族成員JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun在初診多發性骨髓瘤中的表達及臨床意義*

燕法紅,邱志遠,李乾鵬,高偉杰,曹榮旋,王寶宏△

1.濰坊醫學院第一附屬醫院/濰坊市人民醫院血液內科，山東濰坊 261041；2.濰坊醫學院，山東濰坊 261053

多發性骨髓瘤(MM)是一種克隆性漿細胞異常增殖的惡性疾病，約占造血系統疾病的10%，也是血液系統第2常見的惡性腫瘤[1]。近些年來，隨著蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑、單克隆抗體等新的MM治療藥物不斷涌現及造血干細胞移植的進一步應用，MM患者的預后得到了明顯改善，但目前其仍然是一種不可治愈的疾病。進一步研究其發病機制并探索有效的治療藥物是臨床亟待解決的難題。轉錄是DNA通過RNA聚合酶將遺傳信息復制給RNA的過程，是基因表達的第一步。轉錄過程異常在MM的發生、發展中起到重要作用，其可干擾活化的B細胞向漿細胞正常分化，影響免疫球蛋白生成及骨髓微環境信號傳導，導致MM的發生并推動其進展。在轉錄過程中，轉錄因子(TF)是一種非常重要的因子，只有當TF結合在其識別的DNA序列上后才能啟動轉錄。激活蛋白-1(AP-1)是一類重要的TF，通常由Jun蛋白家族(c-Jun、JunB和JunD)、Fos蛋白家族(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、ATF蛋白家族(ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1、JDP2)和Maf蛋白家族(c-Maf、MafA、MafB、MafF/G/K和Nrl)蛋白亞基中的亮氨酸拉鏈區域形成同源或異源二聚體，與DNA靶序列結合，調控靶基因表達[2]。組成成分不同的AP-1二聚體對反應元件親和性不同，其中Jun-Fos異源二聚體 DNA 結合活性最高、最穩定，也是人類細胞中AP-1存在的主要形式。作為基因轉錄調控的分子開關，AP-1參與細胞的增殖、分化、凋亡、轉化、遷移等多種過程，在腫瘤的發生、發展及炎癥反應中發揮重要作用[3-10]。作為TF，AP-1家族在MM的病理生理過程中起到了很大作用，隨著對其研究的不斷深入，AP-1家族成員近年來逐漸成為被廣泛開發的治療新靶點，有望開辟MM治療的新領域。

MM患者臨床指標的變化包括血紅蛋白(Hb)、清蛋白(ALB)水平降低，血清β2-微球蛋白(β2-MG)、球蛋白(GLO)、血肌酐(Scr)、血鈣水平升高，骨髓中異常漿細胞比例增高等，這些指標的水平變化與患者的病情嚴重程度、分期、預后及治療方案的選擇等均有關。關于AP-1家族成員與這些臨床指標之間的關系，相關報道較少。本研究探討了初診MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平與上述臨床指標水平間的相關性，并了解其與患者病情嚴重程度和預后的關系，旨在明確其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年11月至2022年2月濰坊醫學院第一附屬醫院血液內科收治的40例初診MM患者作為研究對象，其中男23例，女17例；年齡39～83歲，平均(64.90±9.35)歲；國際分期系統(ISS)分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期22例。MM診斷與分期標準參照《中國多發性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)》[1]。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2試劑與儀器 PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒、TB Green Premix Ex Taq熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司，Trizol試劑購自杭州艾科瑞生物科技有限公司，紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自天津灝洋華科生物科技有限公司。實時熒光定量PCR引物由華大基因科技股份有限公司合成。Light Cycler480熒光定量 PCR 儀購自瑞士羅氏公司。

1.3方法

1.3.1骨髓有核細胞提取與凍存 MM患者行常規骨髓穿刺，抽取骨髓液2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，加入紅細胞裂解液，室溫下靜置10 min，300×g離心10 min，PBS洗滌2次，棄上清液，細胞沉淀中加入Trizol試劑，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平 提取總RNA，按照PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。然后進行PCR，按照TB Green Premix Ex Taq熒光定量試劑盒說明書操作，反應條件：變性95 ℃ 30 s，1個循環；PCR 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；融解95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃，1個循環；降溫50 ℃ 30 s，1個循環。JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun及內參β-actin的引物序列見表1。根據2-ΔΔCt法計算JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA的表達水平。

1.3.3臨床指標收集 收集MM患者的臨床指標，包括年齡、血清β2-MG、Hb、GLO、ALB、Scr、血鈣、骨髓漿細胞比例。

表1 引物序列

2 結 果

2.1MM患者臨床指標水平 納入的MM患者Hb(90.95±28.92)g/L，GLO(52.05±26.20)g/L，ALB(35.06±8.55)g/L，血清β2-MG 5.65(4.20,9.12)mg/L,Scr 78.50(60.50,175.00)μmol/L,血鈣(2.50±0.51)mmol/L，骨髓漿細胞比例(37.70±22.03)%。

2.2不同性別MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平比較 不同性別MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3不同ISS分期MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平比較 ISS分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表2 不同性別MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平比較或M(P25,P75)]

表3 不同ISS分期MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平比較或M(P25,P75)]

2.4MM患者JunB mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性 MM患者JunB mRNA表達水平與GLO水平呈正相關(r=0.320,P=0.044)，與其余指標水平無相關性(P>0.05)，見表4。

表4 MM患者JunB mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性

2.5MM患者c-Maf mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性 MM患者c-Maf mRNA表達水平與GLO水平呈正相關(r=0.350,P=0.027)，與ALB水平呈負相關(r=-0.316,P=0.047)，與其余指標水平無相關性(P>0.05)，見表5。

表5 MM患者c-Maf mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性

2.6MM患者c-Fos mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性 MM患者c-Fos mRNA表達水平與血鈣水平呈正相關(r=0.317,P=0.046)，與其余指標水平無相關性(P>0.05)，見表6。

表6 MM患者c-Fos mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性

2.7MM患者c-Jun mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性 MM患者c-Jun mRNA表達水平與各項臨床指標水平均無相關性(P>0.05)，見表7。

表7 MM患者c-Jun mRNA表達水平與臨床指標水平間的相關性

3 討 論

AP-1功能異常與淋巴瘤、MM等血液系統腫瘤關系密切。在淋巴瘤中，AP-1在經典型霍奇金淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤、原發性皮膚淋巴瘤等多種亞型中表達異常[11-12]。在MM中，AP-1不同亞家族蛋白在MM發生的不同環節中扮演不同的角色。MM的發生涉及B細胞向漿細胞分化、免疫球蛋白的產生與分泌、血管新生、骨病發生、骨髓微環境調節等。Fra-1可抑制B細胞轉化為漿細胞，抑制免疫球蛋白生成[13]；Fra-2在多個不同階段促進B細胞增殖與分化；B-ATF與B細胞的活化、生發中心形成、免疫球蛋白類別轉換有關；c-Maf、MafB可促進MM細胞的增殖、遷移、侵襲、黏附，以及與骨髓基質細胞的相互作用，并誘導對硼替佐米及卡非佐米耐藥；c-Jun抑制MM細胞增殖并誘導其凋亡；JunB促進MM細胞增殖，誘導MM細胞對激素與硼替佐米耐藥，并促進血管新生。此外，c-Fos、Fra-1、Fra-2、JunB都可影響成骨細胞或破骨細胞的功能，與MM骨病的發生密切相關[14-16]。除MM與淋巴瘤外，AP-1在急性髓系白血病中亦可見異常表達[17]。鑒于AP-1在MM發病及進展中的作用，近年來以AP-1作為治療靶點的藥物不斷被研發，個別藥物已進入臨床試驗階段，這些藥物可通過抑制AP-1的表達、誘導AP-1降解、干擾AP-1蛋白之間的相互作用、干擾AP-1與DNA結合，以及表觀遺傳學層面調控等機制起到抗腫瘤作用[6-7,18-21]。

FAN等[10]研究了AP-1家族中最常見的成員(JunB、c-Jun、JunD、c-Fos、c-Maf)在MM中的作用，發現JunB作用最突出,將MM細胞與骨髓基質細胞共培育，JunB在mRNA與蛋白質水平均明顯上調，且JunB與其靶點的結合能力明顯強于其他AP-1家族成員；骨髓微環境中的生長因子，特別是白細胞介素-6，可上調MM細胞中JunB的表達；JunB表達敲低后，MM細胞的生長明顯被抑制，凋亡通路失調，磷脂酰肌醇-3激酶、核因子-κB(NF-κB)、Janus激酶/信號轉導及轉錄激活子、絲裂原活化蛋白激酶等重要信號通路失調，其他受到調控的生物學過程或分子包括DNA復制、代謝、細胞周期、細胞表面分子、細胞因子、生長因子等。在激素耐藥MM細胞株中，JunB的表達水平高于激素敏感MM細胞株；激素耐藥MM細胞株在敲低JunB的表達后可恢復對激素的敏感性，細胞增殖與存活被抑制[10]。在MM細胞株中誘導JunB表達能使細胞產生對硼替佐米的抵抗，有助于細胞存活；同時在正常漿細胞、意義未明單克隆免疫球蛋白血癥、冒煙型MM、MM等不同階段的漿細胞疾病患者中發現，經誘導后JunB mRNA表達水平逐級升高[10]。在MM的血管新生過程中，JunB也起到關鍵作用，其可提高血管內皮生長因子(VEGF)-A、VEGF-B、胰島素樣生長因子-1等促血管生長因子的表達，促進MM血管新生，加速MM進展[14]。此外，JunB的異常表達也可通過影響成骨細胞與破骨細胞的數量與功能參與MM骨病的發生[16]。由于按照Durie-Salmon分期，本研究中絕大部分患者為Ⅲ期，因此未分析JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平與Durie-Salmon分期之間的相關性。本研究發現，MM患者JunB mRNA表達水平與GLO水平呈正相關(r=0.320,P=0.044)，考慮JunB與漿細胞分泌GLO的能力有關。

c-Maf作為原癌基因，在MM細胞中表達上調，可促進MM細胞的增殖、遷移、侵襲以及與骨髓基質細胞的黏附，并誘導對硼替佐米耐藥，同時其還可通過增加VEGF的產生促進血管生成。10%～15%的MM患者出現t(14:16)染色體易位，可累及16q23區域的c-Maf，使c-Maf蛋白呈高表達。本研究中，MM患者c-Maf mRNA表達水平與GLO水平呈正相關(r=0.350,P=0.027)，與ALB水平呈負相關(r=-0.316,P=0.047)。盡管ALB是判斷MM分期的核心指標，GLO水平的高低可反映漿細胞分泌單克隆免疫球蛋白的能力，但本研究未發現c-Maf mRNA表達水平與患者ISS分期有關[不同ISS分期患者c-Maf mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)]，考慮與本研究納入的MM患者集中分布在ISS Ⅱ、Ⅲ期，而ISSⅠ期患者數量較少，可能導致結果偏倚，尚有待進一步擴大樣本量并分析Durie-Salmon分期與AP-1家族成員表達水平的相關性，以明確AP-1是否與MM患者的病情嚴重程度及預后有關。

c-Fos在MM的骨病發生過程中發揮重要作用。c-Fos對破骨細胞的分化具有重要的調控作用。破骨細胞前體細胞表面的NF-κB受體活化因子與其位于成骨細胞的配體結合，募集腫瘤壞死因子受體相關因子，通過c-Jun氨基端激酶途徑誘導c-Jun/Fos活化，調節c-Fos的表達，促進破骨細胞前體分化；同時還能通過NF-κB、蛋白激酶B途徑使c-Fos表達增加，c-Fos與活化的T細胞核因子c1結合，啟動破骨細胞特異性基因轉錄，誘導破骨細胞前體分化為成熟破骨細胞[22]。過表達c-Fos可促進破骨細胞分化，而抑制c-Fos表達則會抑制破骨細胞分化[23]。c-Fos表達上調后可導致破骨細胞活性增加，骨吸收加強，血鈣水平升高。本研究中，MM患者c-Fos mRNA表達水平與血鈣水平呈正相關(r=0.317,P=0.046),提示MM患者隨著c-Fos mRNA表達水平升高，血鈣水平亦升高，說明c-Fos與溶骨程度相關，與上述研究結果相符。

c-Jun作為原癌基因，在多種實體腫瘤中被發現表達上調[7]，然而在對MM的相關研究中發現，其起到抑制MM的作用，MM患者比健康者c-Jun/Fos活性降低；MM患者中，c-Jun低表達水平者比高表達水平者預后更差；誘導c-Jun表達可抑制MM細胞增殖并誘導其凋亡，因此，c-Jun對腫瘤可能起到雙向作用[16]。本研究未發現MM患者c-Jun mRNA表達水平與臨床指標水平存在相關性，考慮可能與其作用的不確定性有關，c-Jun mRNA表達水平與臨床指標的關系有待進一步深入挖掘。

綜上所述，AP-1家族成員JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達水平與MM患者性別、ISS分期無明顯關系；而JunB、c-Maf mRNA表達水平與患者蛋白合成能力相關，c-Fos mRNA表達水平與患者溶骨程度相關，JunB、c-Fos、c-Maf在MM的發病及疾病進展中可能發揮了一定作用，有望為今后MM的相關研究提供一定理論基礎。