胃癌組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平變化及與患者臨床分期和預后的關系*

賈旻蕾，劉瑞麗，李蘭軍

河北省邯鄲市第一醫院普外三科，河北邯鄲 056002

胃癌(GC)是全球范圍內最常見的腫瘤之一，研究數據顯示，2018年全球有超過100萬的GC新發病例，至2020年我國GC發病率約為24.30/10萬，新發病例約為34.6萬，總病死病例超過37萬[1-2]。盡管隨著診療技術的不斷進步，GC患者生存期逐漸延長，但GC發生、發展的分子機制尚未完全明確，患者5年生存率仍處于較低水平[3-4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)母系表達基因3(MEG3)是第一個被發現的具有抑癌基因活性的lncRNA家族成員，相關研究表明，肝細胞癌、前列腺癌組織中lncRNA MEG3表達缺失，而lncRNA MEG3表達缺失有利于腫瘤血管新生，促進腫瘤組織惡性演變[5-6]。微小RNA(miR)-7-5p是位于9q21染色體上的一種核糖核酸，研究證實，其在非小細胞肺癌等低放射敏感性的腫瘤細胞內表達上調，其表達水平可能與腫瘤治療反應性有關[7]。本研究對GC組織中lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平變化及與患者臨床分期及預后的關系進行了探討，以期為臨床診療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年12月本院收治的104例GC患者為研究對象，將患者的GC組織標本作為GC組，對應的癌旁組織標本作為癌旁組織組，另選取同期52例行手術治療的胃良性腫瘤患者的腫瘤組織標本作為良性腫瘤組。 104例GC患者中臨床分期Ⅰ期28例，Ⅱ期36例，Ⅲ期26例，Ⅳ期14例。納入標準：(1)GC組患者符合GC診斷標準[8]，良性腫瘤組患者符合胃良性腫瘤的診斷標準[9]；(2)患者均為首次確診，入組前未經手術、放化療等任何相關治療；(3)原發性腫瘤；(4)GC患者病理檢查診斷為腺癌；(5)GC患者經評估可實現R0切除或需行姑息性切除術；(6)預計生存期>3個月。排除標準：(1)合并其他類型腫瘤；(2)伴肝、腎、心等重要器官功能障礙；(3)卡氏評分(KPS評分)<70分，不耐受手術者；(4)有腹部手術史者。GC組與良性腫瘤組患者性別、年齡、體質量指數(BMI)、飲食習慣、吸煙史、飲酒史比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經本院醫學倫理委員會審批通過，研究對象對研究內容知情同意，并簽署知情同意書。

表1 GC組與良性腫瘤組患者一般資料比較

1.2方法 取手術收集的標本100 mg置于研磨器中，加Trizol試劑1 mL，研磨器置于液氮中研磨，靜置5 min，提取總RNA，參照加拿大Fermentas公司生產的反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，檢測純度后液氮保存待用。引物由金斯瑞生物科技有限公司提供。lncRNA MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；miR-7-5p上游引物5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUU-3′，下游引物5′-CAACAAAAUCACUAGUCUUCCAUU-3′。反應條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環，設置3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平。

1.3觀察指標 (1)對比3組lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平。(2)對比不同臨床分期GC患者GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平，并分析GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平與患者臨床分期的相關性。(3)分析GC患者臨床分期的影響因素。(4)隨訪24個月，比較GC組織不同lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平患者的生存情況。

2 結 果

2.1GC組、癌旁組織組、良性腫瘤組lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平比較 GC組lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平低于癌旁組織組、良性腫瘤組，癌旁組織組lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平高于良性腫瘤組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平與患者臨床分期的關系 不同臨床分期患者GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，隨著臨床分期的進展，GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平呈降低趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。Spearman相關分析結果顯示，GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平與患者臨床分期均呈負相關(r=-0.527、-0.501，P<0.05)。

2.3影響GC患者臨床分期的單因素分析 不同臨床分期GC患者性別、年齡、BMI、飲食習慣、吸煙史、飲酒史、腫瘤最大徑、腫瘤位置、脈管癌栓情況、神經浸潤情況、腫瘤類型比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同臨床分期GC患者組織分化程度、合并胃潰瘍情況、浸潤深度比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表2 GC組、癌旁組織組、良性腫瘤組lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平比較

表3 不同臨床分期患者GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平比較

表4 影響GC患者臨床分期的單因素分析結果[n(%)或

續表4 影響GC患者臨床分期的單因素分析結果[n(%)或

2.4影響GC患者臨床分期的多因素Logistic回歸分析 以臨床分期作為因變量，以表3、表4中差異有統計學意義的指標作為自變量進行多因素Logistic回歸分析，變量賦值情況見表5。結果顯示，GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平為GC患者臨床分期的影響因素(P<0.05)。見表6。

表5 變量賦值情況

2.5GC組織不同lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平患者生存情況比較 對GC患者隨訪24個月，期間失訪3例，死亡21例，生存80例。分別以GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p表達水平均值為界分組，>均值為高表達，≤均值為低表達。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，lncRNA MEG3高表達患者生存率高于lncRNA MEG3低表達患者(χ2=5.344，P=0.021)；miR-7-5p高表達患者生存率高于miR-7-5p低表達患者(χ2=5.208，P=0.023)。生存曲線見圖1、圖2。

表6 影響GC患者臨床分期的多因素Logistic回歸分析結果

圖1 GC組織不同lncRNA MEG3表達水平患者生存情況

圖2 GC組織不同miR-7-5p表達水平患者生存情況

3 討 論

GC發病機制復雜，病因也尚未完全明確，超過90%的GC病理類型為腺癌，GC早期缺乏典型癥狀，多數患者就診時已是中、晚期[10-11]。積極探明GC發生、發展相關分子機制是指導臨床完善治療方案、提升患者治療效果的關鍵。

近年來有關GC預后的研究主要集中在血清學指標，有研究發現，糖類抗原19-9、癌胚抗原等腫瘤標志物對評估GC患者病情轉歸具有一定臨床參考價值，但限于GC發生、發展機制復雜的特征，總體評估效果并不理想[10]。隨著對基因組學研究的不斷深入，發現基因組序列中僅2%可被翻譯為蛋白質，其余大部分轉錄成非編碼RAN，lncRNA是轉錄本長度超過200個核苷酸的一類RNA分子的總稱，其與轉錄、表觀遺傳等的調控有關，且與腫瘤發生、發展也有一定關系。lncRNA MEG3是定位在染色體14q32.3上的長度為1.6 kb的一種小鼠母系印記基因GTL2人類同系物，生理狀態下其在卵巢、腦等組織內高表達[12-13]。有研究證實，敲除lncRNA MEG3可強化胰腺癌細胞增殖活力及侵襲、遷移能力，且lncRNA MEG3低表達會增加中年人群結直腸癌的發生風險[14]。本研究結果顯示，GC組織中lncRNA MEG3表達水平明顯低于癌旁組織及胃良性腫瘤組織(P<0.05)，分析出現該結果的原因如下：(1)lncRNA MEG3可與蛋白編碼基因上游啟動子區域結合而影響下游基因表達；(2)lncRNA MEG3能抑制RNA聚合酶Ⅱ或調節染色質重構、組蛋白修飾，調控下游基因表達；(3)lncRNA MEG3與蛋白基因轉錄本結合形成互補雙鏈，影響mRNA剪切；(4)lncRNA MEG3與蛋白基因轉錄本結合形成互補雙鏈后在Dicer酶作用下生成內源性siRNA，繼而調節基因表達[15-16]。lncRNA MEG3通過上述轉錄調控、蛋白修飾及染色質重塑等多個層面調控靶基因表達，發揮生物學效應，當其表達水平降低時可直接造成對應基因表達調控機制失衡，甚至引起細胞無序增殖、生長。因此，GC發生、發展可能與lncRNA MEG3表達水平異常有關。進一步經Spearman相關分析結果顯示，GC組織lncRNA MEG3表達水平與患者臨床分期呈負相關(P<0.05)，提示lncRNA MEG3表達水平降低可增強腫瘤惡性生物學行為。本研究多因素Logistic回歸分析結果顯示，GC組織lncRNA MEG3表達水平是患者臨床分期的影響因素，lncRNA MEG3可能在GC發生、發展中發揮抑癌基因活性。有研究發現，脈管癌栓情況、分化程度等均是GC患者臨床分期的影響因素[17-18]，但本研究未得出類似結論，可能與納入研究的樣本量、樣本選擇不同有關。

研究證實，miR-7-5p能通過靶向基因抑制結直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移，且能提高耐藥腫瘤細胞的敏感性[19-21]。本研究發現，GC組織中miR-7-5p表達水平明顯低于癌旁組織及胃良性腫瘤組織(P<0.05)，提示miR-7-5p可能與lncRNA MEG3具有相同的生物學活性。相關研究顯示，miR-7-5p可通過Kruppel樣因子4/磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶/p21通路扼制前列腺癌干細胞樣特性[22]。推測miR-7-5p也可能通過調控GC細胞生物學功能而實現抗腫瘤作用。本研究相關性分析發現，GC組織miR-7-5p表達水平與患者臨床分期呈負相關(P<0.05)。分析出現該結果可能與以下機制有關：miR-7-5p能抑制GC細胞內表皮生長因子受體表達，進而阻斷GC細胞的侵襲及遷移，另外，miR-7-5p可通過靶向抑制REGγ表達阻斷細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖，而在GC細胞內REGγ同樣是miR-7-5p的靶基因，其能高度特異性抑制GC細胞增殖，而腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移是臨床分期進展的主要特征。此外，本研究隨訪發現，GC組織lncRNA MEG3、miR-7-5p高表達患者生存率高于低表達患者，提示lncRNA MEG3、miR-7-5p與GC患者的預后有關，可作為判斷患者生存情況的重要指標。

綜上所述，GC組織中lncRNA MEG3、miR-7-5p水平呈異常低表達，且表達水平越低的患者臨床分期越高，預后相對更差，lncRNA MEG3、miR-7-5p可作為GC病情及預后評估的參考指標。