回顧性分析單核苷酸多態性微陣列分析技術在胎兒先天性心臟病診斷中的應用價值*

林 琴，黃秀瓊，毛雅珍，沈玲英，劉欣茹

福建醫科大學附屬福州市第一醫院：1.檢驗科；2.產科，福建福州 350000

先天性心臟病(CHD)是指胚胎時期心臟發育受環境、藥物、宮內感染、基因突變或染色體異常等因素影響，引起胎兒心血管發育異常的一組疾病，根據《中國出生缺陷防治報告(2012)》顯示，CHD的發病率在出生缺陷中排首位[1]。有研究表明，在產前診斷為CHD的胎兒中，染色體異常約占30%[2]。因此，產前篩查時對超聲檢查提示胎兒CHD的孕婦，建議經超聲介導進行侵入性遺傳學檢測，這對了解CHD的遺傳學病因具有重要的臨床意義。染色體核型分析是目前最常用的產前細胞遺傳學分析技術，也是產前細胞遺傳學診斷的“金標準”，但該技術存在操作繁瑣、細胞培養周期長、分辨率低(>10 Mb)等缺點。有研究表明，染色體拷貝數變異(CNV)所導致的微缺失或微重復綜合征占染色體畸變所致出生缺陷的1/2[3]，與傳統染色體核型分析技術相比，染色體微陣列分析技術能在全基因組水平檢測不平衡CNV[4]，目前其主要分為單核苷酸多態性微陣列(SNP array)分析技術和微陣列比較基因組雜交(aCGH)分析技術，染色體微陣列分析技術具有高分辨率、高通量、周期短、不需要細胞培養，只需要少量DNA即可檢測等優點，在不平衡CNV的檢測方面彌補了染色體核型分析的不足，臨床醫生可根據CNV結果給孕婦提供合理的建議，因而染色體微陣列分析技術被廣泛應用于產前遺傳學診斷中。本研究對140例超聲心動圖提示胎兒CHD的孕婦進行羊水染色體核型分析和SNP array分析，以探討SNP array分析技術在診斷胎兒CHD中的價值，為臨床診治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2021年12月因超聲心動圖提示胎兒CHD就診于本院遺傳咨詢門診的妊娠18～25周孕婦140例，所有孕婦均行羊膜腔穿刺術采集標本，均進行染色體核型分析及SNP array分析。納入標準：(1)超聲心動圖提示胎兒CHD，包括房/室間隔缺損、與心臟連接的血管結構異常、心臟瓣膜結構異常、大動脈轉位、心臟位置異常、心臟腫瘤等;(2)單胎妊娠；(3)無放射性物質接觸史、無宮內感染。排除標準:(1)家屬或孕婦不同意參與本研究;(2)超聲心動圖提示胎兒心臟僅有軟指標異常，包括心臟點狀強回聲、三尖瓣或二尖瓣反流、心律失常、心律不齊等。對符合上述標準的孕婦，由經驗豐富的產前遺傳咨詢醫生介紹兩種細胞遺傳學檢測技術，包括技術的局限性及檢測可能存在的風險等。所有研究對象及其家屬均簽署知情同意書，本研究經過本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1標本采集 超聲心動圖提示胎兒CHD的孕婦在妊娠18～25周由經驗豐富的臨床醫生在超聲介導下行無菌羊膜腔穿刺術，抽取羊水30 mL用于染色體核型分析和SNP array分析。

1.2.2染色體核型分析 將采集的羊水離心后，用貼壁細胞法培養獲得羊水細胞制片，G顯帶后對中期分裂相染色體進行分析。

1.2.3SNP array分析 采用美國Affymetrix公司生產的CytoScan 750k芯片試劑盒，將標本DNA與高密度覆蓋單核苷酸多態性(SNP)和CNV探針的基因芯片雜交，在全基因組水平進行檢測，參考國際公共基因數據庫及相應指南對結果進行判讀。判讀結果分為致病性CNV(pCNV)、良性CNV、臨床意義不明確CNV(VOUS)。

1.3統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1140例CHD胎兒超聲心動圖檢查結果 在140例CHD胎兒中，孤立性心臟畸形66例(47.14%)，其中孤立性房/室間隔缺損36例(25.71%)，孤立性大動脈轉位15例(10.71%)，孤立性瓣膜異常3例(2.14%)，孤立性永存左上腔靜脈11例(7.86%)；多發性心臟畸形34例(24.29%)；合并心外畸形40例(28.57%，包括中樞神經系統、消化系統、泌尿系統畸形及鼻骨缺失、唇腭裂、四肢畸形、單臍靜脈)；最常見的心臟畸形為室間隔缺損，有單獨存在，也有合并心臟其他畸形或心外畸形存在，共檢出79例(56.43%)。

2.2不同類型CHD胎兒SNP array分析和染色體核型分析檢出的染色體異常結果比較 對140例超聲心動圖提示CHD的胎兒羊水均進行兩種技術的檢測，SNP array分析檢出染色體異常20例(14.29%)，其中孤立性心臟畸形中有3例，多發性心臟畸形中有5例和合并心外畸形中有12例；染色體核型分析檢出染色體異常9例(6.43%)，其中孤立性心臟畸形中有0例，多發性心臟畸形中有1例，合并心外畸形中有8例；兩種檢測技術染色體異常檢出率比較差異有統計學意義(χ2=2.157，P<0.05)，見表1。SNP array分析在室間隔缺損胎兒中檢出染色體異常14例。SNP array分析在未合并心外畸形胎兒中檢出染色體異常占8.00%(8/100)，在合并心外畸形胎兒中檢出染色體異常占30.00%(12/40)，差異有統計學意義(χ2=3.093，P<0.05)。超聲心動圖提示合并心外畸形胎兒中，兩種檢測技術均檢出6例染色體非整倍體異常，含有1例13-三體，2例18-三體，3例21-三體。

2.3兩種檢測技術檢出染色體異常結果的差異 140例CHD胎兒中，SNP array分析檢出微缺失5例，微重復9例，嵌合體1例；而染色體核型分析檢出嵌合體2例，微缺失1例，微重復1例，9號染色體臂間倒位4例。染色體核型分析漏檢微缺失4例，微重復8例，均在染色體核型分析無法常規檢測到的大小范圍內；比較兩種檢測技術對微缺失和微重復的總檢出率，差異有統計學意義(χ2=8.0211，P<0.05)。SNP array分析漏檢9號染色體臂間倒位4例，低比例嵌合體1例(核型結果：45,X[6]/46,XX[75])。

2.4SNP array分析檢出染色體異常中CNV結果 SNP array分析檢出14例CNV，其中pCNV 3例，分別為3q29微缺失綜合征、8p23.1缺失綜合征、16p11.2缺失綜合征各1例，有2例進行家系驗證：1例來源于母親，1例來源于新發突變；VOUS 11例，其中5例進行家系驗證，4例來源于母親，1例來源于父親，見表2。

表1 不同類型CHD胎兒SNP array分析和染色體核型分析檢出的染色體異常結果比較[%(n/n)]

表2 SNP array分析檢出的CNV及胎兒表型

序號片段大小包含基因相關疾病CNV遺傳性研究妊娠結局11.6MbDLG1、FBXO45、PAK2等17個OMIM基因3q29微缺失綜合征母源性,母親表型正常引產212.3MbCLN8、GATA4等42個OMIM基因8p23.1缺失綜合征新發引產31.0MbTUFM、SH2B1等20個OMIM基因16p11.2缺失綜合征未知引產41.4MbPMP22等5個OMIM基因不明確未知出生正常,早產51.7MbPLGLA、RGPD3等4個OMIM基因不明確母源性,母親表型正常出生6個月死亡(原因不明)6560.6kbCNTN6不明確父源性,父親表型正常出生正常71.4MbZFP42不明確未知CHD8512.3kbNIPA等4個OMIM基因不明確母源性,母親表型正常引產91.8MbTRPM1、CHRNA7等7個OMIM基因不明確母源性,母親表型正常引產10432.5kbCHRNA7不明確未知出生正常

續表2 SNP array分析檢出的CNV及胎兒表型

3 討 論

CHD是目前臨床常見的出生缺陷疾病之一，隨著外科技術的進步，大部分CHD患兒可通過手術獲得良好的預后,但仍有一部分復雜的CHD胎兒由于本身的染色體異常，導致出生后可能同時合并發育遲緩、特殊面容、智力障礙、免疫力低下等問題，使得患兒無法得到有效治療，給社會、家庭造成巨大的負擔。故胎兒期篩查和診斷CHD不應只局限于超聲影像學檢查，還應進行遺傳病因層面的檢測和分析，從而更有利于對CHD患兒預后的判斷及降低胎兒出生缺陷率。本研究通過對140例超聲心動圖提示為CHD的胎兒染色體核型分析和SNP array分析結果進行比較，探討胎兒CHD與染色體異常，尤其是與不平衡CNV的關系，以及SNP array分析在CHD診斷中的應用價值。

室間隔缺損是最常見的CHD之一，本研究CHD中室間隔缺損共79例(56.43%)，在心臟畸形中排首位，同時在室間隔缺損胎兒中SNP array分析檢出染色體異常14例(17.72%,14/79)。張璘等[5]報道室間隔缺損的胎兒染色體異常檢出率為16.67%(10/60)，與本研究數據相近，可見室間隔缺損的胎兒染色體異常檢出率較高。本研究通過SNP array分析發現，合并心外畸形的胎兒染色體異常檢出率明顯高于未合并心外畸形的胎兒(P<0.05)，與趙穎等[6]的報道結果一致。上述結果提示在產前超聲心動圖顯示胎兒存在室間隔缺損時應重視遺傳學病因分析結果，特別是提示合并多器官畸形時，需聯合行SNP array分析，有助于查找胎兒發育畸形的根本原因。

本研究中，SNP array分析染色體異常的檢出率為14.29%，染色體核型分析染色體異常檢出率為6.43%，相較于傳統染色體核型分析，SNP array分析能將染色體異常檢出率提高7.86%。有研究顯示，相較于染色體核型分析，SNP array分析將染色體異常檢出率提高了5.26%[7]，本研究染色體異常檢出率提高值略高于上述報道，可能是與入組的CHD類型不同、病例總數不同等有關。兩種檢測技術均檢出相同的6例染色體非整倍體異常，1例嵌合體和1例微缺失，但SNP array分析對微缺失、微重復的總檢出率明顯高于染色體核型分析(P<0.05)，有4例微缺失和8例微重復被SNP array分析檢出而染色體核型分析均未檢出異常。與染色體核型分析相比，SNP array分析最大的優勢在于其可檢出>100 kb的不平衡CNV，因其高分辨率的特點，大大提高了染色體異常的檢出率，因此近年來其成為產前遺傳學診斷的主流技術。另外，本研究還發現4例9號染色體臂間倒位和1例低比例嵌合體，染色體核型分析檢出而SNP array分析未提示異常，因SNP array的方法學特性,其無法檢出染色體臂間倒位及小于25%的低比例嵌合體，因此在產前推薦使用兩種技術聯合檢測，能有效提高染色體異常的檢出率。

本研究共檢出14例CNV，包括pCNV 3例，VOUS 11例。其中1例3q29微缺失屬于明確的致病性CNV。3q29微缺失/微重復綜合征是一種顯性遺傳的罕見病，DLG1、FBXO45、PAK2被認為是參與3q29微缺失綜合征的候選基因[8]，該疾病在個體間可呈現多樣的臨床表型，累及各個器官、系統，最嚴重的表現是CHD，最常見的是胃腸道癥狀，多有神經、精神發育障礙，包括自閉癥譜系障礙和精神分裂癥等[9]。有研究報道，3q29微缺失綜合征以室間隔缺損、唇腭裂等多發畸形為臨床表型[10]。本研究中，經家系驗證該片段的缺失來源于母親。

8p23.1缺失片段中含有GATA4基因，GATA4是轉錄因子編碼基因，其編碼的蛋白在胚胎發育過程中心臟的發育中發揮重要的調節作用。已有研究報道，GATA4基因缺失會導致室間隔缺損及先天性膈疝，因此GATA4被認為是關鍵致病基因[11-12]；另一項關于CHD與8p23.1缺失相關性的研究發現，8p23.1缺失綜合征臨床表型以不同程度的CHD多見，主要有室間隔缺損、肺動脈閉鎖、主動脈關閉不全、大動脈轉位、持續性左上腔靜脈等[13]，本研究與上述報道表型相符。除了發生CHD外，8p23.1缺失還可能引起面部畸形、多指、腦發育障礙、智力障礙等異常，8p23.1區域缺失片段的位置和大小、包含基因、遺傳外顯率等因素可能導致不同的臨床表型，但目前尚不明確是與GATA4外顯率有關還是存在其他的致病基因[14]。本研究該例8p23.1缺失綜合征胎兒經家系驗證，父母均正常，考慮該染色體異常可能來源于新發突變。

據報道，16p11.2缺失綜合征的臨床表型存在異質性，16p11.2遺傳位點的CNV與神經發育障礙高度相關，主要表現為自閉癥、癲癇、智力障礙[15]；另有研究報道，涉及SH2B1基因的16p11.2缺失綜合征也與嚴重的早期肥胖和糖尿病有關[16]。本研究16p11.2缺失綜合征表現為室間隔缺損等心臟異常、雙側腦室重度積水、單臍動脈，與LI等[17]的研究結果一致。

本研究共檢出11例VOUS,其中1例為17p12缺失，內含PMP22等5個OMIM基因，PMP22基因的突變與遺傳性周圍神經疾病和遺傳性神經病變伴壓力性麻痹有關[18]。PMP22基因是一種劑量敏感基因。劑量敏感基因可能與其他基因(例如蛋白質合成基因)以濃度依賴的方式相互作用，可能產生高濃度下易于聚集的蛋白質(例如SNCA28)，或者可能具有實現功能所需的最低濃度(即單倍體不足基因，包括許多轉錄因子和發育基因)[19]。當這些基因的劑量被重疊的CNV改變時，基因的功能會被破壞，從而引起疾病。目前，含有PMP22基因的17p12片段缺失以CHD為臨床表型的相關報道少見,因此17p12缺失與CHD的相關性還有待研究。

本研究中3例檢測出pCNV的孕婦選擇引產。相對于參考基因組，每個個體平均有1 000個>450 bp的CNV[20]。基因組中的一些區域是CNV好發區域，約10%的人類基因組經歷了反復的CNV[21]，這種變異通常不會產生表型，因為CNV通常是小的、發生在基因間的或包含可以耐受拷貝數變化的基因，有些基因甚至可以被完全刪除而沒有明顯的表型[22]，故當SNP array分析結果為VOUS時，臨床醫生需進一步通過家系驗證來判斷其來源，并且結合父母的表型給予更準確合理的遺傳咨詢。本研究11例VOUS中，有5例進行家系驗證，其中4例來源于母親(妊娠結局：2例引產，1例出生6個月死亡，1例出生正常)，1例來源于父親(妊娠結局：出生正常)，其余6例拒絕進一步驗證(妊娠結局：1例引產，1例發生CHD，3例出生正常，1例失訪)。

本研究的不足之處：由于本研究為回顧性研究，并非所有的VOUS病例均進行了夫婦驗證，且5例明確遺傳來源的病例中有2例還是選擇引產，這種病例是遺傳咨詢的難點，遺傳咨詢醫生應通過查找數據庫及文獻，對VOUS的檢測結果進行判讀和解釋，在孕婦和家屬充分理解的基礎上，盡量減少非必要的引產。

綜上所述，SNP array分析技術比傳統染色體核型分析具有更高的分辨率，能更準確地篩查出CNV，提高染色體異常的檢出率，為臨床醫生的診斷提供更多的遺傳學依據。但該技術也有一定的局限性，可能會漏檢染色體平衡性結構重排(如易位、倒位、插入)、低比例嵌合體，另外，對于SNP array分析結果為VOUS者，增加了臨床醫生遺傳咨詢的難度，也給患者帶來了困擾。因此，本研究認為，染色體核型分析聯合SNP array分析技術在胎兒CHD診斷中更有利于正確評估胎兒預后，在產前遺傳咨詢中尤為重要。