ITP患兒APA與IVIG治療效果、Treg細胞、Th17細胞的關系

賈萬理，楊 陽△，晉 婕，蘇立貞，孟 潔，劉羨偉，高 楠

1.西安高新醫院輸血科，陜西西安 710075；2.西安金域醫學檢驗所有限公司，陜西西安 710018；3.西安高新醫院生殖醫學科，陜西西安 710075；4.西安高新醫院檢驗科，陜西西安 710075

免疫性血小板減少癥(ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病，皮膚和黏膜出血是主要臨床表現，兒童是急性ITP的主要發病人群[1]。ITP的發病機制尚不完全清楚，其主要機制是患者對自身抗原的免疫失耐受，導致免疫介導的血小板破壞增多及免疫介導的巨核細胞產生血小板不足[2]。目前，ITP尚無根治方法，臨床上主要以對癥治療為主。靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)、糖皮質激素等多種方法被用于ITP患兒的臨床治療，但部分患兒會產生耐受及治療效果不佳等，嚴重影響預后，甚至會危及生命[3]，因此尋找一種能預測ITP患兒治療效果的指標顯得至關重要。抗血小板抗體(APA)是一種自身抗體，有研究顯示，APA在ITP患兒的陽性表達率較高，抗GPⅡb/Ⅲa IgM抗體與出血嚴重程度之間存在關聯[4]，提示APA檢測可能有助于ITP患兒預后和治療的決策指導。本研究探討了ITP患兒APA與IVIG治療效果及調節性T細胞與輔助性T細胞17比值(Treg/Th17細胞比值)的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2021年12月西安高新醫院收治的160例ITP患兒作為研究對象。納入標準：原發性ITP，符合《2019年美國血液學會免疫性血小板減少癥指南》[5]中兒童ITP的診斷標準；新診斷為ITP(病程小于3個月)；年齡≤12歲。排除標準：繼發性ITP；伴有急慢性感染、活動性出血等。按照APA檢測結果將其分為APA陽性組(76例)與APA陰性組(84例)。APA陽性組男40例，女36例；年齡1～10歲，平均(4.12±1.78)歲；血小板計數(PLT)為(4.27±1.05)×109/L。APA陰性組男45例，女39例；年齡1～12歲，平均(4.53±1.61)歲；PLT為(4.80±1.16)×109/L。兩組年齡、性別等基線資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經西安高新醫院醫學倫理委員會審查批準，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1治療方法 治療藥物：醋酸潑尼松片(上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020675)，口服，1 mg/(kg·d)；靜脈注射用人免疫球蛋白(IVIG，浙江海康生物制品有限責任公司，國藥準字S19993039)，靜脈注射，0.4 g/(kg·d)。連續治療5 d，治療期間每2天檢測1次患兒血常規及凝血功能。于治療第14天進行治療效果評價。治療期間未輸注血小板。

1.2.2效果評價 按照文獻[6]報道的標準對治療效果進行評價。(1)完全反應：PLT>100×109/L，沒有出血癥狀；(2)有效：PLT>30×109/L且較基線水平升高2倍及以上，無出血癥狀；(3)無效：達不到以上條件。治療總有效率=(完全反應例數+有效例數)/總例數×100%。

1.2.3APA、PLT及Treg/Th17細胞比值檢測 (1)APA檢測：于治療前采集患兒外周靜脈血3 mL，離心獲取血清，將凍干血小板(抗原)與血清等比例混合，于37 ℃孵育30 min，蒸餾水洗滌5次，加入抗人IgG與紅細胞，使用專用離心機進行離心，觀察檢測結果。判定標準：紅細胞部分聚集或平鋪在底部判定為陽性，紅細胞平滑聚集在底部中央判定為陰性。(2)PLT檢測：于治療前及治療第14天采集患兒外周靜脈血3 mL，采用HF-3800全自動血細胞分析儀(上海寰熙醫療器械有限公司)測定PLT。(3)Treg/Th17細胞比值檢測：于治療前及治療第14天分別采集患兒外周靜脈血3 mL，采用Percoll分離液分離外周血單個核細胞，然后對Treg細胞、Th17細胞進行標記，再采用BD FACSVia流式細胞儀測定Treg/Th17細胞比值。

2 結 果

2.1兩組治療效果的比較 APA陽性組完全反應48例，有效15例，無效13例，治療總有效率為82.89%；APA陰性組完全反應30例，有效14例，無效40例，治療總有效率為52.38%。APA陽性組的治療效果明顯優于APA陰性組，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.2兩組PLT及Treg/Th17細胞比值比較 治療第14天，兩組PLT、Treg細胞及Treg/Th17細胞比值較治療前明顯升高(P<0.05)，Th17細胞較治療前明顯降低(P<0.05)，且APA陽性組PLT明顯高于APA陰性組(P<0.05)，但兩組Treg細胞、Th17細胞及Treg/Th17細胞比值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3APA、PLT與治療效果、Treg細胞、Th17細胞的相關性 Spearman相關性分析顯示，APA與治療效果呈正相關(r=0.472，P<0.05)，與Treg細胞、Th17細胞均無明顯相關性(r=0.086、-0.109，P=0.317、0.253)；PLT與治療效果、Treg細胞呈正相關(r=0.472、0.508，均P<0.001)，與Th17細胞呈負相關(r=-0.412，P<0.001)。

表1 兩組治療前后PLT及Treg/Th17細胞比值比較

3 討 論

目前，兒童ITP的發病機制并無定論，但關于免疫介導的病理機制在兒童ITP中的研究得到了很大發展，臨床上治療ITP患兒的目標是將PLT恢復到能滿足止血要求的水平[7]。IVIG是來源于健康捐贈者血清的血液制品，含有健康人血漿中所有的特異性抗體成分，主要是IgG，以及少許IgA和IgM，具有免疫替代和免疫調節的雙重治療作用[8]。IVIG已經成為臨床治療ITP患兒的主要手段，但是部分患兒對于其治療反應性并不高，PLT不能維持在有效水平，會對預后產生不利影響[9]。因此，尋找一種能預測ITP患兒IVIG治療效果的指標具有重要的臨床實踐意義。

ITP患兒機體內產生的APA免疫介導機制已經得到普遍認可，ITP患兒APA陽性率明顯高于健康人[10]。APA能夠能作用于GPⅡb/Ⅲa等血小板糖蛋白及巨核細胞表面，對巨核細胞的凋亡及血小板產生2條途徑進行雙重抑制，導致外周血液中PLT出現不同程度的降低[11]。本研究結果顯示，治療后，與APA陰性組患兒相比，APA陽性組患兒的治療效果更好，PLT更高，APA、PLT與治療效果呈正相關，提示APA可能是預測ITP患兒IVIG治療效果的一項指標。目前，IVIG治療ITP患兒的具體機制還不清楚，大部分學者認為其機制是免疫球蛋白阻斷巨噬細胞Fcl受體，從而抑制血小板吞噬功能[12]。此外，免疫球蛋白能對免疫細胞進行調節，從而下調致病性抗體(如APA等)水平[13]。近年來，T淋巴細胞在兒童ITP發生、發展中的作用已得到重視；有研究顯示，Treg細胞缺失或功能發生異常，能激活Th17/IL-17細胞受體軸，使Th17細胞功能亢進，引起IL-17水平及Th1/Th2比值升高，機體細胞因子發生異常，免疫抑制轉化生長因子水平降低，導致B淋巴細胞的增殖，從而誘發抗體介導的自身免疫反應[14-15]。本研究中，治療后，兩組患兒Treg細胞及Treg/Th17細胞比值較治療前明顯升高，Th17細胞較治療前明顯降低，提示IVIG治療后，ITP患兒機體內的免疫狀態通過重建，逐漸趨于穩定；但治療后兩組Treg/Th17細胞比值差異無統計學意義(P>0.05)，PLT與Treg細胞呈正相關，與Th17細胞呈負相關。這提示Treg、Th17細胞水平與ITP患兒疾病進展情況存在密切關系。由于ITP患兒的免疫機制非常復雜，馮建軍等[16]的研究顯示，ITP患者血小板特異性抗體與T淋巴細胞亞群及自然殺傷(NK)細胞存在一定的相關性。但是本研究發現，APA與Treg細胞、Th17細胞無相關性，可能與本研究納入的病例數不足有關，需要進一步深入研究。

綜上所述，ITP患兒APA與IVIG治療后Treg細胞、Th17細胞變化無相關性，但與治療效果存在相關性，提示APA可能成為ITP患兒IVIG治療效果的預測指標。本研究結果仍需進行多中心、大樣本研究進行驗證。