慢性心力衰竭患者外周血lncRNA MIAT和miR-214水平變化及與預后關系

薛俊芳，王 涵

1.舞陽縣人民醫院心內科，河南漯河 462400；2.漯河市中心醫院檢驗科，河南漯河 462000

慢性心力衰竭(CHF)為各種常見心臟病嚴重終點事件之一，是老年人死亡的主要原因，而且醫療費用較高，給患者家庭和社會帶來了沉重負擔。CHF的高發病率、高患病率和高病死率仍然是一個社會問題，其診斷和治療越來越受到重視[1]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于一類長度超過 200 個核苷酸的非蛋白質編碼 RNA，通過調節基因表達參與表觀遺傳調控。lncRNA存在于循環系統中，可作為反映心血管疾病局部疾病過程的獨立生物標志物[2]。研究表明，lncRNA心肌梗死相關轉錄物(MIAT)參與了多種疾病的多個病理過程，包括糖尿病視網膜病變、心肌梗死、微血管功能障礙、心臟肥大和心肌纖維化[3]，其中心肌纖維化是心血管疾病進展為CHF的決定性因素。微小RNA(miRNA)的主要功能是影響基因穩定性，或者通過結合非翻譯區mRNA 3′末端全部或部分抑制下游靶基因mRNA的翻譯，參與生理和病理過程，影響疾病的發生和進展[4]。最近的研究發現，許多心臟疾病的發生、發展受到miRNA相關信號通路的影響，如肥大和纖維化[5]。miR-214是miRNA家族成員，可通過轉錄水平抑制組蛋白賴氨酸甲基轉移酶 1，提高過氧化物酶體增殖物激活受體表達，進而降低心肌細胞纖維化相關基因的表達[6]，與心血管疾病存在一定的聯系。本研究檢測CHF患者外周血中lncRNA MIAT和miR-214的表達，研究其對CHF患者預后價值，以期為CHF提供新的臨床預后診斷指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月在舞陽縣人民醫院確診和治療的50例CHF患者作為觀察組，均接受心電圖、胸部X線片、彩色多普勒超聲檢查，符合紐約心臟協會(NYHA)的分級標準，左室射血分數(LVEF)≤40%，左室舒張末期內徑(LVEDD)>5.5 cm。觀察組男28例，女22例；年齡65～81歲，平均(73.71±6.53)歲；有吸煙史23例，無吸煙史27例；體重指數(BMI) 22～25 kg/m2，平均(23.28±1.25)kg/m2；空腹血糖4.02～7.47 mmol/L，平均(5.93±1.28)mmol/L；丙氨酸氨基轉移酶(AST) 15～28 U/L，平均(21.34±5.87)U/L；天門冬氨酸氨基轉移酶(ALT)13～24 U/L，平均(18.64±5.24)U/L；心功能分級：Ⅱ級21例，Ⅲ級18例，Ⅳ級11例。排除自身免疫性疾病、急性冠狀動脈綜合征、肝功能障礙、慢性感染和惡性腫瘤患者。另選取同期在本院體檢健康的受試者30例作為對照組，男16例，女14例；年齡64～79歲，平均(71.27±6.82)歲；有吸煙史14例，無吸煙史16例；BMI 23～26 kg/m2，平均(24.46±1.31)kg/m2；空腹血糖4.04～7.51 mmol/L，平均(5.71±1.65)mmol/L；AST 14～26 U/L，平均(20.17±5.38)U/L；ALT 12～25 U/L，平均(18.57±5.64)U/L。排除有心臟相關功能異常、自身免疫性疾病和高血壓病史者。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。該研究得到了醫院倫理委員會的批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2方法 收集患者一般資料，包括LVEDD、LVEF和腦鈉肽(BNP)水平。采集患者空腹4 mL 的靜脈血液標本，置于含有乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的抗凝管中，充分混勻，并以 400×g離心 20 min分離血漿。分離的血漿儲存在-80 ℃低溫冰箱中備用，用于細胞因子的測定。

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血漿lncRNA MIAT和miR-214的表達。采用TRIzol試劑盒提取收集的血漿中的總RNA。通過紫外分光光度法檢測總RNA的純度、濃度和完整性。參照說明書采用TaqMan逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)進行逆轉錄。lncRNA MIAT和miR-214分別以GAPDH和U6為內參，引物由廣州天元生物技術有限公司合成。逆轉錄反應體系體積為15 μL。lncRNA MIAT正向引物為5′-TATTTGCAG GGGGTGCTCTG-3′，反向引物為5′-GGGCAG GGGGTCTAACTCTA-3′，擴增長度為126 bp；GAPDH正向引物為5′-GAGCCACATCGCTCAGAACA-3′，反向引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′，擴增長度為71 bp；miR-214正向引物為5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCT-3′，反向引物為5′-ATGTGACTGCCTGTCTGTGC-3′，擴增長度為71 bp；U6正向引物為5′-CGCCACATGGCATATTGCAC-3′，反向引物為5′-CAGCCATCGGGTATGCTAT-3，擴增長度81 bp。擴增體系：cDNA 1.0 μL，正向引物 0.4 μL，反向引物 0.4 μL，2×SYBR Green Premix Dimer Eraser，并添加無核酸酶水，最終體積為 20 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共38 個循環。使用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達水平。

1.3隨訪 所有患者接受正規治療，并通過門診、微信或電話進行隨訪。統計1年內終點事件發生情況；每2個月進行1次，以患者因心力衰竭再次入院或全因死亡為終點事件，根據是否發生終點事件分為終點事件組及無終點事件組。

2 結 果

2.1lncRNA MIAT、miR-214、BNP、LVEDD、LVEF水平比較 觀察組BNP、lncRNA MIAT、LVEDD水平明顯高于對照組，miR-214、LVEF明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA MIAT、miR-214、BNP、LVEDD、LVEF水平比較

2.2終點事件組及無終點事件組一般資料比較 隨訪1年后，依據患者1年內是否發生終點事件分為終點事件組(28例)和無終點事件組(22例)。終點事件組及無終點事件組患者性別、吸煙史、BMI、空腹血糖、AST、ALT、LVEDD和LVEF比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。終點事件組年齡、BNP、lncRNA MIAT水平明顯高于無終點事件組，miR-214明顯低于無終點事件組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 終點事件組及無終點事件組一般資料比較或n(%)]

2.3相關性分析結果 Starbase在線軟件預測結果顯示，lncRNA MIAT靶向miR-214存在結合位點。Pearson相關性分析顯示，CHF患者的lncRNA MIAT水平與LVEDD、BNP水平呈正相關(P<0.05)，與LVEF、miR-214水平呈負相關(P<0.05)；miR-214水平與LVEDD、BNP水平呈負相關(P<0.05)，與LVEF呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 相關性分析結果

2.4各指標對CHF患者預后的預測價值 ROC曲線分析顯示，lncRNA MIAT+miR-214 預測CHF患者預后的曲線下面積(AUC)最大，為0.890，大于BNP、miR-214單獨檢測的AUC，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各指標預測CHF患者預后價值

3 討 論

心力衰竭是世界范圍內常見的健康問題，會導致殘疾、生活質量和預期壽命的降低。盡管已有較多方法來處置心力衰竭，包括借助醫療器械、藥理學手段和遠程監控技術，但心力衰竭的臨床治療效果仍然相對較差。研究顯示，多種因素與疾病的發展有關，而遺傳因素在這一過程中起著核心作用。lncRNA通過調節相關基因的表達在心力衰竭發生、發展中發揮關鍵作用。TAN等[7]研究發現，冠心病患者血清lncRNA MIAT顯著升高，其可能是冠心病診斷和預測預后的潛在標志物。YAO等[8]研究證明，MIAT 下調可減輕動脈纖維化和動脈纖維化誘導的心肌纖維化，并靶向 miR-133a-3p調節相關功能。

本研究中，觀察組患者血漿中的lncRNA MIAT水平明顯高于對照組，且終點事件組lncRNA MIAT水平明顯高于無終點事件組，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示lncRNA MIAT可能與CHF的發生和進展有關。本研究通過相關性分析發現，lncRNA MIAT水平與LVEDD呈正相關，與LVEF呈負相關，提示lncRNA MIAT水平可以反映CHF患者的心臟損傷程度。lncRNA MIAT與BNP水平呈正相關，說明lncRNA MIAT可以反映CHF患者的預后。

基因表達失調是發生CHF的常見機制，并且miRNA在CHF的代謝調節中發揮關鍵作用。研究表明，miR-214在CHF患者中上調并抑制轉錄因子(TF)X-box結合蛋白1(XBP1)介導的內皮細胞血管生成。LI等[9]研究發現，miR-214通過調節瓣膜間質細胞的成骨分化減弱主動脈瓣鈣化。而HE等[10]研究顯示，miR-214-3p-Sufu-GLI1是一種新型調控軸，可控制干細胞和新生內膜增生的炎性平滑肌細胞分化。另外，miR-214在各種心臟疾病中發揮作用，包括缺血性心臟病、心臟肥大、肺動脈高壓(PAH)、血管損傷后的血管生成和心力衰竭。本研究中，觀察組患者血漿miR-214水平相對于對照組明顯下調，且終點事件組miR-214水平明顯低于無終點事件組，說明miR-214可能參與CHF的發生和疾病的進展。相關性分析發現，miR-214水平與LVEDD呈負相關，與LVEF呈正相關，提示miR-214水平與CHF患者的心臟的損傷程度有關；miR-214與BNP呈負相關，說明miR-214與CHF患者血管損傷有關。

lncRNA MIAT可能通過靶向miR-214和相關信號通路參與多種癌癥的進展。例如，lncRNA MIAT水平升高可抑制miR-214表達，促進肝細胞癌患者細胞增殖；lncRNA MIAT可通過調控miR-214的表達，影響心血管疾病患者預后。LI等[11]研究發現，lncRNA MIAT 敲低通過在動脈粥樣硬化過程中調節 miR-214-3p/Caspase-1 信號傳導來減輕內皮細胞損傷。lncRNA-MIAT 介導的 miR-214-3p 沉默是糖尿病心肌病和心臟纖維化發生的原因[12]。本研究通過Starbase在線軟件預測到lncRNA MIAT可以靶向miR-214，抑制并逆轉了miR-214 對CHF的影響。相關性分析也進一步證明lncRNA MIAT可與miR-214結合。本研究中，lncRNA MIAT、miR-214、BNP對CHF患者1年內的預后預測具有一定的價值，但存在靈敏度或特異度較低的缺點；lncRNA MIAT+miR-214 預測預后的AUC為 0.890，靈敏度為61.4%，特異度為100.0%，AUC和特異度明顯提高，說明lncRNA MIAT+miR-214對CHF患者預后有較好的預測價值。

總之，lncRNA MIAT可以靶向miR-214調控CHF的發生和進展，對預測CHF患者預后有一定的價值，可能成為預測CHF患者預后的標志物。但由于本研究涉及的CHF相關臨床指標較少，其具體機制還不太明確，這些指標能否廣泛應用于臨床還有待于進一步研究。