膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1在泛癌中的預(yù)測作用

戴龍飛，王 旭，柏 濤，陳 博，楊文奇

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230032

膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1（acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase-1，ACAT1）是一種將膽固醇轉(zhuǎn)換為膽固醇酯的酶，可導(dǎo)致Warburg效應(yīng)和腫瘤生長[1-2]。通過抑制ACAT1表達(dá)可增強(qiáng)T細(xì)胞效應(yīng)器功能[3]。早有研究[4-6]表明，ACAT1表達(dá)水平與大多數(shù)腫瘤預(yù)后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示，ACAT1可能是泛癌患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，存在于腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段[7]。許多“癌癥標(biāo)志”都與腫瘤微環(huán)境有關(guān)，包括誘導(dǎo)增殖和抑制細(xì)胞凋亡、抑制免疫系統(tǒng)避免免疫監(jiān)測以及激活免疫細(xì)胞等[8]。在腫瘤微環(huán)境中鑒定治療靶標(biāo)可用于治療癌癥[9]。腫瘤細(xì)胞通過激活免疫檢查點(diǎn)通路逃避免疫監(jiān)視，而免疫檢查點(diǎn)抑制劑可恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)[10]。腫瘤新抗原具有高度免疫原性，可激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，影響免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效[11]。錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制、腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相互關(guān)聯(lián)，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的敏感性有關(guān)，可以用于預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果[12-15]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可誘導(dǎo)T細(xì)胞吸引并增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的功效[16]。

這項(xiàng)研究中，我們分析了ACAT1基因在泛癌患者中的預(yù)后及免疫作用。通過TCGA及GTEX數(shù)據(jù)庫下載泛癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)和臨床生存數(shù)據(jù)，通過K-M生存分析探討ACAT1基因在泛癌中的預(yù)后價(jià)值。利用TIMER數(shù)據(jù)庫，研究ACAT1基因與腫瘤免疫浸潤的關(guān)系，尤其是膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）和腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）。最后，運(yùn)用SangerBox分析ACAT1基因與免疫治療的預(yù)測標(biāo)志物（包括腫瘤新抗原、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、錯(cuò)配修復(fù)缺陷、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）之間的關(guān)系。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ACAT1基因在泛癌預(yù)后和免疫浸潤中的重要作用。

1 材料與方法

1.1材料

通過TCGA及GTEX數(shù)據(jù)庫下載泛癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)和臨床生存數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 K-M生存分析 繪制Kaplan-Meier曲線分析泛癌中ACAT1基因表達(dá)水平與生存率的關(guān)系，包括總生存率（overall survival，OS），疾病特異生存率（disease free survival，DSS），無病生存率（disease-free interval，DFI）和無進(jìn)展生存率（progression free survival，PFI）。閾值設(shè)置為Cox P值＜0.05。探討ACAT1基因表達(dá)水平對泛癌的OS、DSS、DFI和PFI的影響。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、BLCA、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肝細(xì)胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、直腸癌（Rectum adenocarcinoma，READ）、KIRC、腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）和腦低級別膠質(zhì)瘤（brain lower grade glioma，LGG）中分析ACAT1基因表達(dá)與OS、DSS、DFI和PFI的相關(guān)性。計(jì)算95%CI的危險(xiǎn)比（HR）和對數(shù)秩P值。

1.2.2 TIMER中ACAT1表達(dá)與泛癌免疫浸潤的關(guān)系 TIMER是一個(gè)全面的資源數(shù)據(jù)庫，用于系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤。用TIMER數(shù)據(jù)庫測定ACAT1基因表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系，是系統(tǒng)分析不同癌癥類型免疫浸潤的理想資源。TIMER應(yīng)用統(tǒng)計(jì)反褶積方法，從基因表達(dá)譜推斷腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的豐度。TIMER數(shù)據(jù)庫包含了來自TCGA的32種癌癥類型的10 897個(gè)樣本，用于評估免疫浸潤的豐度。從TIMER數(shù)據(jù)庫中下載泛癌的6種免疫浸潤細(xì)胞的得分?jǐn)?shù)據(jù)，分析基因表達(dá)與免疫細(xì)胞得分的相關(guān)性。分析ACAT1基因的表達(dá)與6種免疫浸潤細(xì)胞之間的關(guān)系，包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。使用R軟件包estimate分析各個(gè)腫瘤樣本的免疫評分和基質(zhì)評分，同時(shí)測定ACAT1基因的表達(dá)水平與腫瘤純度的關(guān)系。

1.2.3 Sanger Box Sanger Box工具盒（http://sangerbox.com/）是一款具有多種生物信息分析，可視化作圖和便捷數(shù)據(jù)下載功能的工具。本研究收集了常見的四十多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因，利用Sanger Box分析ACAT1基因表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因的關(guān)系，同時(shí)分別提取這些免疫檢查點(diǎn)基因，計(jì)算與ACAT1基因表達(dá)水平的相關(guān)性。此外，本研究還利用Sanger Box分析了ACAT1基因與泛癌患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑的預(yù)測標(biāo)志物（包括腫瘤新抗原、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、錯(cuò)配修復(fù)基因突變、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）的相關(guān)性。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Kaplan-Meier生存曲線探討ACAT1表達(dá)水平與泛癌的預(yù)后的關(guān)系。此外，利用Sanger Box分析ACAT1基因表達(dá)與免疫治療的預(yù)測標(biāo)志物之間的關(guān)系。基因表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACAT1基因在腫瘤組織和正常組織中的差異表達(dá)

通過收集TCGA及GTEX數(shù)據(jù)庫中泛癌組織和正常組織的標(biāo)本，分析ACAT1基因在不同腫瘤和鄰近正常組織中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示：在大部分癌癥中ACAT1基因表達(dá)水平明顯低于鄰近正常組織，而在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）、腦低級別膠質(zhì)瘤（brain lower grade glioma，LGG）和腎嫌色細(xì)胞癌（kidney Chromophobe，KICH）中明顯高于臨近正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 ACAT1基因在腫瘤組織和正常組織中的差異表達(dá) 個(gè)

2.2 ACAT1基因在泛癌中的預(yù)后分析

利用K-M生存分析進(jìn)一步評估ACAT1基因與預(yù)后的關(guān)系。ACAT1基因低表達(dá)顯著提高了HNSC的OS、DSS、DFI和PFI。ACAT1基因低表達(dá)顯著提高了LAML的OS。在PCPG和COAD中，ACAT1基因低表達(dá)對其DFI具有保護(hù)作用。而在BLCA中，ACAT1基因低表達(dá)顯著提高其OS和DSS，但是在KIRP患者中，低ACAT1基因表達(dá)對其OS和DSS不利。另外，ACAT1基因顯著降低了READ中的PFI。在KIRC和LGG中，ACAT1基因?qū)S、DSS和PFI均不利。最后研究還發(fā)現(xiàn)，ACAT1基因低表達(dá)顯著降低了LUAD的DSS和PFI。考慮到以上結(jié)果中HR值僅為0.98，0.99和1.02等，我們對以上腫瘤的ACAT1表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后發(fā)現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 ACAT1基因在泛癌中的預(yù)后分析

2.3 ACAT1基因與免疫浸潤的關(guān)系

本研究進(jìn)一步評估了泛癌中ACAT1基因表達(dá)與免疫浸潤水平的相關(guān)性，確定不同腫瘤組織中ACAT1基因的表達(dá)是否與6種免疫浸潤細(xì)胞（B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）相關(guān)。結(jié)果顯示：與免疫浸潤細(xì)胞最顯著相關(guān)的3種腫瘤分別為BLCA、LGG和肉瘤（sarcoma，SARC）。

本研究還分析了在泛癌中ACAT1基因表達(dá)與免疫評分、基質(zhì)評分和綜合評分的關(guān)系。結(jié)果顯示：與免疫評分最顯著相關(guān)的為BLCA、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）和KIRC，與基質(zhì)評分最顯著相關(guān)為LIHC、THCA和KIRC，與綜合評分最顯著相關(guān)為胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、THCA和KIRC。基于以上發(fā)現(xiàn)，我們選擇KIRC代表當(dāng)ACAT1基因低表達(dá)水平時(shí)生存率低的癌癥，而BLCA代表生存率良好的癌癥。對于KIRC，ACAT1基因表達(dá)水平與免疫評分（R=-0.319,P=6.21e-14）呈顯著負(fù)相關(guān)，而對于BLCA，與免疫評分（R=0.336，P=4.04e-12）呈顯著正相關(guān)，并且與CD4+T細(xì)胞、 CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤水平呈顯著正相關(guān)。此外，KIRC中的ACAT1基因表達(dá)水平與腫瘤純度呈正相關(guān)，而在BLCA中無相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)有力地表明，在KIRC和BLCA中，ACAT1基因通過與免疫浸潤相互作用而影響患者生存，見表3。

表3 ACAT1基因與免疫浸潤的關(guān)系 分

另外，本研究還分析了ACAT1基因與免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)關(guān)系。在乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）、 LIHC、 KIRC、 THCA、 KIRP及LUAD中，ACAT1與免疫檢查點(diǎn)基因顯著負(fù)相關(guān)。

2.4 ACAT1基因表達(dá)水平與腫瘤新抗原、腫瘤突變負(fù)荷（tumormutationalburden，TMB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）的關(guān)系

本研究分析了ACAT1基因表達(dá)水平與腫瘤新抗原數(shù)量、TMB及MSI的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，在BRCA中，ACAT1基因表達(dá)水平與新抗原數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.133，P=0.000 31）；在BRCA中ACAT1基因表達(dá)水平與TMB顯著負(fù)相關(guān)（-0.36＜R＜0，P=8.5e-13）,在PAAD中ACAT1基因表達(dá)水平與TMB顯著負(fù)相關(guān)（-0.36＜R＜0，P=1.4e-06）；在BRCA中ACAT1基因表達(dá)水平與MSI顯著負(fù)相關(guān)（-0.27＜R＜0，P=0.006 7）,在THCA中ACAT1基因表達(dá)水平與MSI顯著負(fù)相關(guān)（-0.27＜R＜0，P=0.003 5）。

2.5 ACAT1基因表達(dá)水平與錯(cuò)配修復(fù)缺陷（different mismatch Repair，dMMR）及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系

評估錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及EPCAM突變與ACAT1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)ACAT1基因低表達(dá)時(shí)，LIHC錯(cuò)配修復(fù)基因的MSH2（-0.25＜R＜0，P＜0.001）及MSH6（-0.25＜R＜0，P＜0.05）突變率高，容易出現(xiàn)dMMR。

我們進(jìn)一步分析了ACAT1表達(dá)與四個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B）的關(guān)系。結(jié)果顯示：ACAT1基因表達(dá)水平與LIHC中的甲基轉(zhuǎn)移酶顯著負(fù)相關(guān)，與葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma，UVM）及PAAD顯著正相關(guān)，見表4。

表4 ACAT1基因表達(dá)水平與dMMR及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系

3 討論

ACAT1是CD8+T細(xì)胞中膽固醇酯化的主要酶，抑制ACAT1活性可顯著增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)器功能，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖。這是由于CD8+T細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平的增加，增強(qiáng)了T細(xì)胞受體聚集和信號(hào)傳遞以及更有效地形成免疫突觸[17]。這些證據(jù)表明，抑制ACAT1活性可提高機(jī)體的免疫力，同時(shí)為腫瘤的預(yù)后和免疫治療提供新方向。

ACAT1基因被證實(shí)與多種癌癥的增殖相關(guān)[18-20]。因此我們推測，ACAT1基因可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖影響患者的生存。與正常組織相比，ACAT1基因在大部分腫瘤組織中表達(dá)水平較低。在LAML、PCPG、COAD、BLCA、HNSC中，ACAT1基因低表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)，而在LUAD、READ、KIRC、KIRP、LGG中預(yù)后較差。

BLCA和KIRC在免疫浸潤和ACAT1基因表達(dá)之間的相關(guān)性方面有不同的模式，這些發(fā)現(xiàn)目前為止尚屬首次。在BLCA和KIRC中，ACAT1基因表達(dá)具有不一致的預(yù)后價(jià)值。ACAT1基因低表達(dá)與BLCA的良好預(yù)后相關(guān)，而KIRC則相反，這與Chen L等[21]的研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)ACAT1基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間存在顯著相關(guān)性，尤其在BLCA和KIRC中，ACAT1基因的表達(dá)與不同的免疫浸潤水平相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，ACAT1基因的表達(dá)與BLCA中免疫細(xì)胞評分顯著正相關(guān)，而與KIRC顯著負(fù)相關(guān)。BLCA的免疫浸潤與ACAT1基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)，而KIRC呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示，ACAT1基因表達(dá)與某些免疫細(xì)胞標(biāo)志物之間的關(guān)系并不總是與整體趨勢相同，ACAT1與某些免疫細(xì)胞亞型之間可能具有某種特定的相互作用，這種特定的相互作用目前尚未可知，需要更多的研究去證實(shí)。更加有趣的是，在BLCA中ACAT1基因的表達(dá)水平與腫瘤的純度無關(guān)，而在KIRC中與腫瘤純度呈顯著正相關(guān)。這一證據(jù)提示，ACAT1在BLCA腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中同樣表達(dá)，而僅在KIRC腫瘤細(xì)胞中相對富集，這種差異可能與腫瘤微環(huán)境中不同的ACAT1基因富集方式有關(guān)。作為重要的抗原提呈細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是BLCA中與ACAT1表達(dá)最顯著相關(guān)的細(xì)胞類型，然而在KIRC中則不是。因此，我們推測腫瘤在向腫瘤微環(huán)境招募抗原提呈細(xì)胞時(shí)存在異質(zhì)性，這一結(jié)果與Patente TA等[22]的研究結(jié)果相似。ACAT1基因在腫瘤中免疫浸潤細(xì)胞的募集和調(diào)節(jié)中起著重要作用，最終可能影響患者的生存。

當(dāng)免疫檢查點(diǎn)基因高表達(dá)時(shí)，免疫檢查點(diǎn)活躍，使抗原不能被提呈至T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞的免疫功能，腫瘤得以逃脫生存。Hu F F等[23]的研究表明，在癌癥樣本中上調(diào)免疫檢查點(diǎn)基因的數(shù)量越多，越適用于免疫治療。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ACAT1低表達(dá)時(shí)，BRCA、LIHC、KIRC、THCA、KIRP及LUAD中的免疫檢查點(diǎn)基因顯著高表達(dá)，這說明這些腫瘤適用于免疫治療。研究表明，腫瘤新抗原數(shù)目多、高TMB、高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability high， MSI-H）、錯(cuò)配修復(fù)缺陷及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制，腫瘤免疫治療效果越好。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ACAT1基因低表達(dá)時(shí)：BRCA的新抗原數(shù)量多、高TMB、MSI-H，這與Bianchini G等[24]的研究結(jié)果一致；THCA患者具有MSI-H，這與Ferrari SM等[25]的研究結(jié)果一致；PAAD具有高TMB及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶受到抑制，Schizas D等[26]發(fā)現(xiàn)免疫治療聯(lián)合其他治療可協(xié)同作用于PAAD； UVM的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶受到抑制，Heppt M V等[27]發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)阻斷聯(lián)合CTLA-4和PD-1抑制是迄今為止UVM最有效的治療方法；LIHC錯(cuò)配修復(fù)缺陷及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)，錯(cuò)配修復(fù)基因高突變時(shí)可增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性強(qiáng)時(shí)會(huì)降低免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效，這說明免疫治療僅對某些LIHC患者有益，免疫治療在LIHC中的免疫反應(yīng)差異很大，這一現(xiàn)象可能與以下原因有關(guān)，Cao D等[28]發(fā)現(xiàn)LIHC患者的預(yù)后與T細(xì)胞浸潤的免疫表型（CD8表達(dá)）和適應(yīng)性免疫抵抗基因（B7-H3或CD47）的表達(dá)有關(guān)，B7-H3患者低/CD8高或CD47低/CD8高的存活率最高，而B7-H3高/CD8低或CD47高/CD8低的存活率最差。

綜上所述，BRCA、LIHC、KIRC、THCA、KIRP、LUAD、PAAD及UVM的免疫治療效果好，而ACAT1基因低表達(dá)可作為泛癌的免疫治療預(yù)測標(biāo)志物。