番石榴葉水提物對四氧嘧啶誘導體外胰島INS-1細胞凋亡的保護作用及其機制

梁結斐 陳震堯 吳偉斌

1.肇慶醫學高等專科學校藥學院，廣東肇慶 526020；2.廣東省肇慶市中醫院藥劑科，廣東肇慶 526020；3.肇慶醫學高等專科學校基礎醫學院，廣東肇慶 526020

《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》數據顯示，我國18 歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%[1]。國內研究表明，胰島β 細胞功能減退是我國居民2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）遺傳易感性的主要因素[2]，而高血糖[3]及高血脂[4]是誘發胰島β 細胞功能減退的常見原因。上述兩種因素損傷胰島β 細胞的機制與誘發氧化應激[5]、內質網應激[6]、線粒體功能障礙[7]及自噬[8]有關，加上與胰島β 細胞自身的低抗氧化應激能力[9]的共同作用下，機體逐漸發展為糖尿病。四氧嘧啶（alloxan，ALX）是一種常見的用于制備糖尿病在體動物或離體細胞模型的細胞毒性試劑，可通過升高細胞內活性氧及誘發胰腺炎癥等方式誘導胰島β 細胞凋亡或壞死[10-11]。番石榴葉（Psidium guajava leaves，PGL）是桃金娘科植物番石榴的葉，是兩廣及福建地區的一種常見茶飲原料，其提取物具有鎮痛[12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14]及護肝[15]等多種藥理作用。在抗糖尿病方面，PGL 提取物已被證明可通過抑制NF-κB 通路及激活AMPK 通路等機制對糖尿病大鼠的心肌[16]、骨骼肌及肝細胞[17]實現保護作用。但PGL提取物能否對胰腺β 細胞具有保護作用及其可能機制尚未清楚。本研究利用ALX 誘導INS-1 細胞構建氧化應激模型，旨在探討PGL 水提物對INS-1 細胞的保護作用及其可能的機制，為進一步開發利用PGL水提物提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究對象為大鼠胰島細胞瘤細胞株INS-1，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

PGL 水提物干粉（江西沐恩堂生物科技有限公司，批號：200517）；RPMI 1640（美國Hyclone 公司，貨號：8121303）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號：13011-8611）；2-巰基乙醇、ALX、TBST即用干粉（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：M6230、A800714、T854550）；CCK-8（上海MedChemExpress 公司，貨號：HY-K0301）；發光法細胞活力檢測試劑盒、抗熒光淬滅封片液（含Hoechst 33342）、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Rhodamine 123（RHD 123）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒、裂解液、封閉液、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0069、P0133、C1062、S0033、C2007、P0010、P0028、P0013、P0252、P0018A）；Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3、GRP78、CHOP、Nrf2、HO-1、Tubulin、Lamin B1 及Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號：AF6139、AF0120、AF7022、AF5366、AF5280、AF0639、AF7018、AF7011、AF5161、S0001）；PVDF膜（美國Millipore 公司，貨號：IPVH00010）。

MCO-18AC 二氧化碳培養箱（日本Panasonic 公司）；SPARK 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；BX53正置熒光顯微鏡及Ⅸ73 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CytoFLEX 流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；SimpliNano 核酸蛋白檢測儀（美國GE 公司）；Powerpac Universal 電泳儀電源（美國Bio-Rad 公司）；iBright FL1000 顯影儀（美國Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 大鼠胰島細胞瘤細胞株INS-1按照RPMI 1640+10%FBS+50 μmol/L 2-巰基乙醇的配方配置完全培養基進行培養；后續實驗分組如表1。

表1 實驗分組及誘導條件

1.2.2 細胞活力檢測 取對數生長期細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，計數后按每孔1×103個細胞鋪入96 孔板，無血清培養過夜，然后按表1 分組換入相應培養基，誘導相應時間后，換入含CCK8 的完全培養基后，把微孔板放入培養箱中避光孵育60 min，最終利用多功能酶標儀檢測450 nm/620 nm（檢測波長/ 參照波長）波長處的吸光度，以0 mmol 組或Control 組為100%換算各組相對存活率，每次實驗每組設置6 個復孔，重復3 次。

1.2.3 化學自發光法檢測細胞內ATP 的含量 取對數生長期細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，計數后按每孔1×103個細胞鋪入全白96 孔板，無血清培養過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml的分組換入相應培養基并誘導4 h 后，按發光法細胞活力檢測試劑盒要求換入檢測液后，用酶標儀檢測孔板中化學發光強度，每次實驗每組設置6 個復孔，重復3 次。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察凋亡形態學、細胞內ROS 及線粒體膜電位 取對數生長期細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，計數后按每孔1×105個細胞鋪入預先放置蓋玻片的6 孔板制備細胞爬片，無血清培養過夜，按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應培養基并誘導24 h 后，取細胞爬片按照Hoechst 33342 染色液的說明書進行封片染色，利用正置熒光顯微鏡進行觀察，每次實驗每組設置3 個復孔，重復3 次。

取對數生長期細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，計數后按每孔1×105個細胞鋪入6 孔板，無血清培養過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應培養基并誘導4 h 后，吸棄上清后，加入配置好的ROS 或Rhodamin 123 檢測試劑，避光37℃孵育15 min，PBS 蕩洗3 次，利用倒置熒光顯微鏡進行觀察，每次實驗每組設置3 個復孔，重復3 次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡、細胞內ROS 及線粒體膜電位 取對數生長期細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，計數后按每孔1×105個細胞鋪入6 孔板，無血清培養過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應培養基并誘導4 h 或24 h 后，消化并以1 000 r/min、半徑8.2 cm、離心5 min收集細胞，吸棄上清后，按AnnexinV-FITC、活性氧及RHD 123 試劑盒要求進行孵育，最后利用流式細胞儀進行檢測，每次實驗每組設置3 個復孔，重復3 次。

1.2.6 Western blot 取對數生長期細胞，胰酶消化后，用無血清培養基重懸，計數后按每孔1×105個細胞鋪入6 孔板，無血清培養過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應培養基，誘導4 h 或24 h 后，消化離心收集細胞，向離心管中加入200 μl 裂解液提取總蛋白，然后利用核酸蛋白定量儀進行蛋白定量，均一化蛋白濃度后，加入上樣緩沖液制備蛋白樣品。電泳分離、轉膜、脫脂奶粉封閉后，配置好所需檢測蛋白的一抗（1∶1 000），低溫搖床4℃過夜孵育，次日以PBST 蕩洗后，室溫孵育二抗（1∶5 000）1 h，最終利用顯影儀檢測以獲得蛋白表達量數據，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗；圖像資料利用Image J 進行半定量分析，GraphPad 8 軟件制作數據圖，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 損傷細胞活力的影響

為確立合適的損傷濃度，梯度濃度的ALX 干預INS-1 細胞24 h 后發現，5 mmol 的ALX 組細胞活力低于0 mmol 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1A），且高濃度ALX 組的細胞活力低于低濃度ALX 組，因此根據研究需求選擇損傷程度適中的濃度進行后續的研究，最終以20 mmol ALX 為建立損傷模型的誘導濃度。確定了損傷濃度后，為建立非損傷性的氧化應激模型，確立相應的誘導時間，以20 mmol ALX 誘導不同時間后發現，當ALX 誘導時間達到6 h 時，INS-1 細胞活力低于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1B），故確定非損傷性的氧化應激模型誘導時間為4 h。為確立研究所使用的藥物劑量，梯度濃度的PGL 水提物干預INS-1 細胞24 h 后發現，當PGL 水提物濃度達到200 μg/ml 時，INS-1 細胞活力低于0 μg/ml 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1C），故后續研究使用不高于200 μg/ml 的劑量進行。建立穩定的ALX 損傷模型并確立安全給藥劑量后，在此基礎上對PGL 水提物保護作用開展研究，結果顯示，25 μg/ml 的PGL 水提物組INS-1 細胞活力高于ALX組，差異有統計學意義（P＜0.05）；100 μg/ml 的PGL水提物組INS-1 細胞活力低于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 藥物對INS-1 細胞活力的影響

2.2 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

20 mmol ALX 干預24 h 可誘導INS-1 細胞凋亡，利用Hoechst 33342 染色后在熒光顯微鏡下觀察，ALX20 組呈現典型核固縮細胞顯著增多（圖2A），而PGL 水提物能劑量依賴地減少核固縮的發生。利用Annxin V-FITC 法結合流式細胞儀檢測也發現，PGL水提物能劑量依賴地減少凋亡細胞的占比（圖2B），逆轉ALX 所誘發的凋亡，保護INS-1 細胞。ALX20 組Bax 及Cleaved-Caspase 3 蛋白的表達量高于Control組，Bcl-2 的表達則低于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。PGL 水提物Bax 及Cleaved-Caspase 3蛋白的表達量低于ALX20 組，高于Control 組，Bcl-2的表達高于ALX20 組，低于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖2 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞凋亡的影響（400×）

圖3 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞Bcl-2、Bax 及Cleaved-Caspase 3 表達的影響

2.3 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞內ATP 含量及線粒體膜電位的影響

經過20 mmol ALX 誘導4 h 建立氧化應激模型，其細胞內ATP 含量及線粒體膜電位低于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；PGL 水提物各劑量組細胞內ATP 含量及線粒體膜電位均高于ALX20 組，低于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4～5）。

圖4 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞內ATP 含量的影響

圖5 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞線粒體膜電位的影響（400×）

2.4 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞內氧化應激及抗氧化應激蛋白表達的影響

利用ALX 誘導INS-1 細胞4 h 建立氧化應激模型，可見ALX20 組細胞內活性氧含量高于Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；PGL 水提物各劑量組細胞內活性氧含量皆低于ALX20 組，高于Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。Nrf2 通路是細胞內關鍵的抗氧化應激通路，上調該通路功能可有效保護胰腺細胞免受氧化應激損傷，結果顯示，PGL水提物各劑量組Nrf2 及HO-1 蛋白的表達量皆高于ALX20 組和Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且PGL 水提物各劑量組的Nrf2 核轉位的程度高于ALX20 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。

圖6 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞內活性氧含量的影響

圖7 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞Nrf2 和HO-1 表達及Nrf2 核轉位的影響

2.5 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞內質網應激相關蛋白表達的影響

ROS 升高、內質網應激及細胞凋亡是三種常見的并行機制介導糖尿病機體多種臟器的病變，利用ALX誘導INS-1 細胞4 h 后發現，ALX20 組的GRP78 及CHOP 兩個內質網應激特征蛋白的表達高于Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；PGL 水提物各劑量組的GRP78 及CHOP 表達量均低于ALX20 組，高于Control 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖8）。

圖8 PGL 水提物對ALX 誘導INS-1 細胞GRP78 和CHOP 表達的影響

3 討論

流行病學調查顯示，2020 年，我國大陸地區成年人糖尿病患病率為12.8%，糖尿病前期患病率高達35.2%[18]，對當下及未來一段時間內中國人民的身體健康及國家醫療衛生支出都將產生巨大的負擔。研究表明[19]，我國居民的飲食習慣改變使得近年高血糖高血脂等問題日漸加劇，而過高的血糖及血脂對胰腺等臟器產生顯著糖脂毒性，誘發全身多種細胞胰島素抵抗，進而增加胰腺細胞的工作負擔，導致胰腺功能減退并最終引發糖尿病[20]。研究表明，糖脂毒性主要通過氧化應激[21]、內質網應激[22]、線粒體功能紊亂[23]及炎癥[24]等機制介導了胰腺細胞的功能失調及凋亡，而天然產物在對抗上述致病機制方面具有很好的療效[25]。ALX 是一種能特異性損傷胰島β 細胞、建立糖尿病動物模型的造模劑[26]，常用于構建體內外胰島β 細胞損傷模型。

本研究通過ALX 誘導大鼠胰島細胞瘤細胞株INS-1 建立胰島β 細胞體外氧化應激模型，研究PGL 水提物對胰島β 細胞的保護作用及其可能的機制。已有研究表明，過度升高的活性氧結合細胞內相對較弱的抗氧化應激能力，可引發線粒體功能紊亂[27]，使得葡萄糖利用能力下降，ATP 合成減少，進而線粒體質量下降，膜電位丟失，最終引發凋亡。本研究結果顯示，非毒性濃度的25～100 μg/ml PGL 水提物能有效對抗20 mmol ALX 所誘導的INS-1 細胞活力下降，呈劑量依賴性地恢復細胞活力，提高細胞內ATP含量，回升線粒體膜電位，減少核固縮細胞占比，降低細胞凋亡率，其機制可能與PGL 水提物可改善線粒體功能、提高Bcl-2 表達、降低Bax 表達并減少Cleaved-Caspase 3 的表達有關，該機制最終阻斷了Caspase 3 途徑所介導的細胞凋亡，實現逆轉ALX 誘導INS-1 細胞損傷的作用。

ALX 誘導β 細胞凋亡，除與線粒體功能紊亂有關外，還與上調細胞內氧化應激及內質網應激[28]有關，且前期研究表明PGL 提取物具有顯著體外抗氧化的作用。本研究結果顯示，PGL 水提物能有效降低細胞內活性氧含量，其調控機制與PGL 水提物能上調Nrf2 及HO-1 蛋白表達并促進Nrf2 核轉位、增強細胞抗氧化應激通路功能有關。除此以外，PGL 水提物還能下調GRP78 及CHOP 的表達，緩解內質網應激，通過多靶點的作用實現對ALX 誘導體外INS-1細胞凋亡的保護作用，但PGL 水提物能否在ALX 誘導的在體糖尿病模型上表現出胰腺保護作用，仍有待進一步的研究。

綜上所述，PGL 水提物可通過調控線粒體功能、減輕細胞內氧化應激及內質網應激對ALX 誘導體外胰島細胞凋亡模型實現保護作用。