FISH技術檢測MDM2基因在脂肪肉瘤診斷中的應用價值及技術質控

李 霄，時姍姍，呂君文，丁 穎，貢其星，李 海，李紅霞

脂肪肉瘤是常見的軟組織惡性腫瘤，形態(tài)學表現多樣，其診斷及鑒別診斷困難。目前WHO(2013)軟組織和骨腫瘤分類確定4種主要的脂肪肉瘤亞型：(1)非典型脂肪瘤樣腫瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumor/well-differentiated liposarcoma, ALT-WDLPS)；(2)去分化脂肪肉瘤；(3)黏液樣脂肪肉瘤；(4)多形性脂肪肉瘤。這4種主要亞型具有獨特的組織學特點、分子遺傳學改變及臨床表現[1-2]，正確分類及精準診斷對患者選擇最佳治療方案至關重要。臨床實踐中，ALT-WDLPS和良性脂肪性腫瘤以及去分化脂肪肉瘤和高級別肉瘤在形態(tài)上常有重疊，易誤診[3]。研究證實ALT-WDLPS和去分化脂肪肉瘤存在共同的遺傳學特征，即攜帶有MDM2、CDK4、HMGA2等基因擴增序列的超額染色體[4]。FISH技術可原位辨識組織細胞內基因組片段的拷貝數變化。因此，FISH技術檢測在脂肪肉瘤不同亞型的鑒別診斷中具有良好的應用前景。然而，目前FISH技術檢測MDM2基因擴增尚無權威診斷指南可供參考，結果判讀多依賴相關文獻及病理診斷醫(yī)師既往經驗，且檢測易受組織前處理、變性雜交、人員操作等諸多因素的影響，其仍未實現全流程質控[5]。本文擬探討MDM2基因擴增在脂肪肉瘤鑒別診斷中的應用價值，分析FISH技術檢測全過程質控環(huán)節(jié)，期望建立規(guī)范化的操作流程，保障結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2020年12月我院病理科脂肪源性腫瘤417例，其中ALT-WDLPS 196例，去分化脂肪肉瘤97例，黏液性脂肪肉瘤15例、多形性脂肪肉瘤22例，良性脂肪性腫瘤87例。

1.2 主要儀器及試劑熒光顯微鏡Olympus BX51(日本奧林巴斯公司)；圖像分析系統(tǒng)Imstar(法國IMSTAR公司)；MDM2(12q15)基因探針(廣州安必平醫(yī)藥公司)。

1.3 FISH法(1)切片：石蠟組織經10%中性福爾馬林固定，脫水包埋，3～4 μm厚連續(xù)切片，置于防脫載玻片上。(2)烤片及脫蠟：70 ℃烤片30～60 min；將切片依次置于3缸二甲苯中脫蠟，室溫，每次10 min；再依次置于2缸100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇，室溫，每次5 min，流水沖洗3 min。(3)修復：將切片置于中性緩沖溶液中，水浴煮沸，煮片20 min。(4)消化：胃酶工作液(2.5 mg/mL)于水浴鍋中37 ℃消化5～10 min，鏡下觀察細胞核裸露情況調整消化時間，消化至細胞核清晰且背景較暗時方可。(5)洗片：將玻片置于2×SSC溶液中室溫漂洗2次，每次3～5 min；將玻片依次置于70%、85%、100%梯度乙醇中脫水各2 min，自然晾干。(6)添加探針：配置MDM2基因探針，移液器吸取10 μL滴于組織上，蓋玻片封片，封片膠封于蓋玻片四周，將玻片置于濕盒中。(7)變性及孵育：水浴箱83 ℃變性10 min；將濕盒置于孵箱37 ℃烘箱過夜孵育。(8)洗片及復染：次日取出玻片，輕輕取下蓋玻片，防止損傷組織，置于70 ℃ 0.4×SSC溶液中2 min；室溫2×SSC漂洗2 min后，置于70%乙醇溶液3 min，并于暗處自然晾干；每張切片加10～15 μL的DAPI復染，靜置10 min后在熒光顯微鏡下閱片。

1.4 結果判讀MDM2基因在正常細胞核上為2紅、2綠信號；當紅綠信號比值>2.0時判讀為陽性；特殊情況下紅綠信號比值<2.0，但紅信號拷貝數>5.0時，提示MDM2基因高拷貝擴增[6-8]，表明此時MDM2基因擴增有意義，報告中予以注釋。FISH結果均由1位高年資病理診斷醫(yī)師及1位高年資病理技術員采用雙盲法進行判讀，如出現結果不一致時，應重復閱片再次計數。

2 結果

2.1 各類脂肪源性腫瘤的臨床特征417例脂肪源性腫瘤中女性195例，男性222例，年齡13～98歲；發(fā)生于腹腔74例，腹膜后73例，軀干70例，四肢131例，睪丸旁13例，腹股溝9例，縱隔16例，頭頸部31例(表1)。

2.2 FISH檢測ALT-WDLPS 196例，MDM2擴增陽性194例(194/196，98.9%)，擴增信號均為簇狀擴增(圖1A)。其中1例可疑陽性，此例信號極弱，經多次重復檢測依然未能明確診斷；另1例陰性，此例更換多個蠟塊重復檢測最終證實為陽性，回顧性分析其HE切片，腫瘤具有異質性。去分化脂肪肉瘤97例，陽性95例(97.9%，圖1B)，陰性2例，結合臨床表現和組織學特征依然診斷為去分化脂肪肉瘤(2例腫瘤均位于腹膜后，HE染色可見經典高分化脂肪肉瘤區(qū)域過渡到多形性肉瘤區(qū)域)。黏液性脂肪肉瘤16例，均未見MDM2陽性擴增信號；多形性脂肪肉瘤22例，部分散在異型大細胞核內可見MDM2低拷貝點狀擴增信號(圖1C)，但不符合陽性診斷閾值。良性脂肪性腫瘤中僅見1例MDM2低拷貝點狀擴增信號，未見簇狀擴增。

2.3 FISH檢測中的技術難點本實驗發(fā)現利用FISH技術檢測MDM2基因的過程中仍存在一些技術難點，主要出現信號較弱或無信號問題，如：(1)組織前期固定不及時或不充分，經酶消化后細胞核彌散或者有空洞，造成信號丟失(圖2A)，易誤判，本組ALT-WDLPS中有1例可疑陽性，腫瘤體積較大，未及時切開固定，造成固定不充分，組織變性明顯，使組織內蛋白及核酸溶解，導致檢測失敗。(2)含酸類脫鈣液(如鹽酸脫鈣液)會使DNA和RNA嚴重降解，導致熒光鏡下細胞核內無熒光信號(圖2B)。(3)酶消化不足會造成蛋白消化不透徹，無法觀察到暴露的細胞核，從而降低了雜交效率且增加判讀難度；消化過度則會出現細胞核消失或辨認不清，導致信號丟失影響判讀(圖2C)。(4)腫瘤異質性的存在，本組ALT-WDLPS中有1例初測陰性，回顧性分析HE切片以分化良好的脂肪成分為主，未見明確間質異型細胞及脂肪母細胞，MDM2檢測未見明確擴增，后更換間質細胞豐富的蠟塊，再次行FISH檢測顯示MDM2基因簇狀擴增從而明確診斷。

3 討論

脂肪肉瘤約占軟組織肉瘤的15%，可發(fā)生于全身多個部位，尤其好發(fā)于深部軟組織，占四肢軟組織肉瘤的24%，占腹腔、腹膜后軟組織肉瘤的45%[2]，其對放、化療不敏感，手術切除后易復發(fā)，因此對于脂肪肉瘤應早發(fā)現、早治療，降低其復發(fā)擴散的可能性。良性脂肪性腫瘤與高分化脂肪肉瘤及脂肪肉瘤各亞型在組織學形態(tài)層面常存在重疊，給鑒別診斷帶來困難[9]。由于良、惡性脂肪肉瘤及不同亞型脂肪肉瘤均具有不同的生物學行為、預后以及治療手段，因此正確診斷及分型對于指導臨床用藥及提示患者預后具有重要意義[8-9]。

近年，FISH作為分子遺傳學診斷技術被廣泛用于臨床病理檢測，包括輔助鑒別診斷、疾病預后評估和指導臨床靶向藥物治療等。研究表明ALT-WDLPS和去分化脂肪肉瘤具有相似的基因組學改變，即位于12q14-15染色體的MDM2、CDK4、HMGA2等諸多基因的特異性擴增[5]。利用FISH技術檢測MDM2基因擴增狀態(tài)已成為多數醫(yī)院診斷脂肪肉瘤亞型的主要手段。由于目前尚無統(tǒng)一的判讀標準，導致MDM2基因的判讀結果具有主觀差異性，FISH結果與最后診斷結果的符合率尚不明確，從而給后期診斷及治療帶來不利影響。

本組分析417例脂肪源性腫瘤的FISH檢測結果，發(fā)現MDM2基因擴增FISH檢測可作為診斷ALT-WDLPS和去分化脂肪肉瘤的可靠手段，此兩種亞型中MDM2基因簇狀擴增陽性率分別為98.9%、97.9%，FISH檢測結果與最終診斷結果具有較高的吻合率。但是也有少數良性病變存在MDM2基因低拷貝點狀擴增，根據其臨床表現、組織學形態(tài)及免疫表型，最終診斷為脂肪瘤等其它良性脂肪性腫瘤。另外，本實驗發(fā)現黏液性脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤的MDM2基因擴增陽性率均為0，表明該基因在脂肪肉瘤不同亞型的診斷上具有重要的鑒別意義。實際工作中觀察到黏液性脂肪肉瘤中均未見MDM2基因擴增信號，但在多形性脂肪肉瘤中會出現散在的部分腫瘤細胞MDM2基因呈低拷貝點狀擴增，未達診斷閾值。因此臨床病理醫(yī)師在脂肪源性腫瘤的診斷過程中，不可僅依靠FISH檢測結果，還是要綜合分析患者的臨床表現、組織學形態(tài)和分子遺傳學等多方面特征，才能最終得出精準診斷。

表1 各類脂肪源性腫瘤的臨床病理特點[n(男 ∶女)]

①A①B①C②A②B②C

在FISH檢測及結果判讀過程中，仍有諸多影響因素，如因組織固定的不及時及充分、脫鈣液使用不當、腫瘤異質性、人為原因的操作失誤以及設備性能的不穩(wěn)定性等，均可能影響最終的檢測結果。因此，我們需要重視檢測全流程的質控、綜合分析，確保FISH檢測結果的可靠性。

作者總結了影響FISH檢測質控的幾個環(huán)節(jié)，并提出以下解決方案：(1)按照規(guī)范及時并充分固定手術大標本及穿刺活檢小標本；(2)骨組織標本取材時應盡可能刮取旁邊的軟組織進行常規(guī)固定脫水，無軟組織必須脫鈣處理時，此樣本不適于FISH檢測；(3)煮片時間不宜過短，過短易造成蛋白解交聯不充分；(4)摸索適宜本實驗室的消化酶濃度及消化時長，定時觀察鏡下每張切片的消化程度，控制消化時間；(5)定期監(jiān)測檢測設備的溫度、濕度是否準確；(6)根據實驗室的設備及試劑特點制定適宜本實驗室的標準操作規(guī)程，并定期培訓。另外，統(tǒng)一的判讀方式是質控環(huán)節(jié)的一部分，針對FISH結果判讀，作者提出以下一些見解：(1)判讀時應計數紅綠通路信號點均為清晰可辨的細胞，并明確為腫瘤細胞方可計數；(2)紅綠信號點不均勻的細胞區(qū)域不予計數；(3)細胞有重疊或者細胞核分辨不清的區(qū)域不予計數；(4)有雜信號或者非特異著色的區(qū)域不予計數；(5)當結果可疑時，需由兩名醫(yī)師計數，保證結果一致；(6)信號微弱或者有空洞的區(qū)域不予計數；(7)腫瘤異質性明顯的組織，建議更換組織檢測。

綜上所述，FISH技術檢測MDM2基因在脂肪肉瘤鑒別診斷中具有重要意義，并針對檢測過程中可能遇到的技術難點及質控環(huán)節(jié)提出全面的質量控制要求。在實際工作中，由于技術本身的局限性，FISH檢測也會出現模棱兩可的判讀結果，此時可利用多種方法如全外顯子組學、轉錄組測序組學(RNA-seq)等高通量技術相互驗證[10-11]，這對于疾病的診斷與鑒別診斷將大有裨益。