維多利亞藍彈性纖維染色常見問題分析與質(zhì)量控制

虞文偉，張順民，鄭建明，唐 峰，冼志紅

特殊染色技術(shù)在日常病理診斷中具有重要意義[1-2]，彈性纖維染色對評估疾病組織中彈性纖維變化、惡性腫瘤的血管侵犯及某些腫瘤的鑒別診斷有重要價值[3-4]。經(jīng)典的Verhoeff彈性纖維染色法只能顯示粗大的彈性纖維[5]；維多利亞藍彈性纖維染色步驟相對較少，可顯示細小彈性纖維，顏色清新；與Van-Gieson復染組合，可對結(jié)締組織成分做出良好的評估。為了普及和提高該染色技術(shù)，上海市臨床病理專科委員會聯(lián)合上海市臨床病理質(zhì)量控制中心，對上海市50家醫(yī)院病理科進行了維多利亞藍彈性纖維染色技術(shù)室間質(zhì)量控制測評。本文對測評中出現(xiàn)的染色缺陷的關(guān)鍵問題進行分析，并探討其主要原因及解決方案，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年5月上海交通大學附屬新華醫(yī)院病理科肺腫瘤切除標本，選擇5例含有胸膜和肺腺癌的代表性蠟塊，由上海醫(yī)學會病理分會技術(shù)組專家制作特殊染色比賽切片。

1.2 方法

1.2.1切片 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)取材，組織脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行HE染色。將5例石蠟標本切片分發(fā)至各參評單位，行維多利亞藍彈性纖維染色。

1.2.2試劑 (1)高錳酸鉀溶液；(2)草酸溶液；(3)彈性纖維染液；(4)Van-Gieson染液。試劑經(jīng)2～8 ℃冰箱保存待用，維多利亞藍彈性纖維染色液購自貝索生物公司。

1.2.3染色步驟 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)高錳酸鉀溶液氧化5 min，稍水洗；(3)草酸溶液漂白2～3 min至切片無色為止，細流水沖洗；(4)95%乙醇稍洗，浸入彈性纖維染液中常溫作用8～24 h(加蓋，避免染液揮發(fā))；(5)95%乙醇或1%鹽酸乙醇分化，快速浸洗至無多余染液脫下(必要時鏡下控制，避免脫色過度)；(6)細流水沖洗3～5 min；(7)用Van-Gieson染液復染1 min，傾去染液，不可經(jīng)水洗；(8)95%乙醇快速分化數(shù)秒，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 結(jié)果判斷高倍鏡下切片彈性纖維染色呈藍黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細胞呈黃色。

1.4 質(zhì)控評分評分標準預先由專家委員會制定，經(jīng)兩位主任醫(yī)師閱片并按標準評分(表1)。本次質(zhì)控著重對染色質(zhì)量進行評分，不包括前期組織處理、組織切片及染色后封固質(zhì)量。評分結(jié)果按下列分數(shù)定級：甲級片≥90分(優(yōu))，乙級片：75～89分(良)，丙級片：60～74分(基本合格)，丁級片：<60(不合格)。

表1 維多利亞藍彈性纖維染色評分標準

2 結(jié)果

本次室間質(zhì)量控制測評，切片合計50張，有48家單位提交染色切片。根據(jù)兩位專家的評分結(jié)果，其中甲級片14張，乙級片26張，丙級片5張，丁級片3張(表2)。

優(yōu)良染色的切片定位準確，染色強度恰當，無非特異性著色，各種染色對比清晰。彈性纖維染色呈藍黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細胞呈黃色(圖1)。可清楚顯示肺組織內(nèi)動脈管壁的彈性纖維，呈藍色，較細、呈波浪狀斷續(xù)曲折，并可顯示損傷的動脈管壁的彈性纖維變性、斷裂和缺失(圖2)。正常肺泡中彈性纖維沿肺泡勾勒出肺泡的大體輪廓(圖3)；可清楚地判斷肺癌細胞與臟層胸膜的關(guān)系。肺癌累及胸膜時，彈性纖維膜斷裂并顯著減少(圖4)。

常見的染色缺陷：(1)彈性纖維淡染，與細胞質(zhì)對比差(圖5)；(2)彈性纖維染色過深而模糊，細胞胞質(zhì)呈灰藍色(圖6)；(3)膠原蛋白呈錯誤的染色或染色不均勻，如膠原蛋白未著色或整個切片染成藍色等假象(圖7)；(4)肌肉和紅細胞未染色或灰色，而不是黃色(表2，圖8)。

表2 維多利亞藍彈性纖維染色效果

3 討論

3.1 染色機制彈性纖維染色的主要機制是帶負電荷的彈性蛋白(含二硫鍵及酸性基團)，與帶有弱正電荷的染料通過非極性吸附完成染色。維多利亞藍彈性纖維染液是維多利亞藍、間苯二酚染料與三氯化鐵絡合，形成維多利亞藍-鐵-間苯二酚色淀。這種復合物的酚基與彈性纖維的某些成分之間形成氫鍵，將彈性纖維染成藍黑色，Van-Gieson染色為對比染色。

維多利亞藍彈性纖維染色可能與以下因素有關(guān)：(1)高錳酸鉀氧化后，部分二硫鍵轉(zhuǎn)化為陰離子的硫酸衍生物，呈強嗜堿性，對染液中的堿性染料具有相對選擇性。高錳酸鉀、草酸處理可增強染色的對比度和深度，氧化時間過長可導致非特異性染色。(2)維多利亞藍成分多樣，可影響彈性纖維的著色；三氯化鐵含有亞鐵鹽也可干擾染色結(jié)果。(3)鹽酸-乙醇分化是決定染色成敗的關(guān)鍵步驟，分化過度細纖維很容易消失。(4)Van-Gieson液的苦味酸如果不飽和，膠原、細胞質(zhì)和肌肉會染上淡粉色到淡橙色，高pH值膠原的選擇性染色減弱。

3.2 染色缺陷及解決方案本次室間質(zhì)量控制評價結(jié)果顯示，66.7%的染色切片彈性纖維定位準確，染色強度恰當，無非特異性著色，對比清晰，但也存在一些染色缺陷。(1)彈性纖維染色過淺、與背景對比差：可能與彈性纖維染液制備不當、染液過舊、不同批號的維多利亞藍及染液中氯化鐵有雜質(zhì)相關(guān)。解決方案：應按正確順序制備彈性纖維染液、使用經(jīng)過認證的染料、維多利亞藍4R效果較好，在鏡下檢查切片分化程度，過度分化可重新染色切片。(2)彈性纖維染色過深、背景呈藍灰色：主要原因是切片脫色不足，應延長在乙醇或鹽酸-乙醇溶液中的分化時間，并在鏡下檢查分化程度。(3)膠原、肌肉和紅細胞未染色或呈灰藍色：主要原因包括Van-Gieson染色試劑陳舊或多次使用，苦味酸未飽和，彈性纖維分化不夠；應及時更換試劑，確保Van-Gieson染色劑中苦味酸的飽和性和適當?shù)膹椥岳w維分化。(4)組織結(jié)構(gòu)成分出現(xiàn)錯誤的顏色或染色不均勻：主要原因包括組織固定不充分、染色分化不當、染色液pH值不正確；應更換固定良好的組織塊，正確的分化并驗證染液的pH值為2.5或更低。

①②③④⑤⑥⑦⑧圖1 彈性纖維染色呈藍黑色,膠原纖維呈紅色,肌纖維和紅細胞呈黃色,維多利亞藍彈性纖維染色法 圖2 肺組織內(nèi)動脈管壁的彈性纖維呈藍色,損傷的動脈管壁的彈性纖維變性、斷裂和缺失,維多利亞藍彈性纖維染色法 圖3 正常肺泡中彈性纖維沿肺泡勾勒出肺泡的大體輪廓,維多利亞藍彈性纖維染色法 圖4 肺癌累及胸膜,彈性纖維膜斷裂并顯著減少,維多

3.3 維多利亞藍彈性纖維染色質(zhì)量控制影響彈性纖維染色結(jié)果的因素包括氧化時間、染料純度和溶液pH值、染色和分化時間等[6]。設(shè)置陽性對照切片最為關(guān)鍵，使用組織芯片與待檢測組織在同一張切片上進行染色。最好使用較小的肌性動脈，因為顯示肌壁內(nèi)的細彈性纖維可更好地確定分化終點，管壁平滑肌黃色；血管周膠原纖維紅色。全自動特殊染色已應用于日常工作，為染色條件的一致性、結(jié)果的準確性和可靠性提供保證。

綜上所述，彈性纖維染色影響因素較多，操作流程中應嚴格掌握和控制染色溫度、染色時間、pH值、試劑配制及保存等細節(jié)，規(guī)范化操作，做好質(zhì)控，以保證染色的穩(wěn)定性和可靠性，更好地服務于臨床病理診斷。