胃癌中PTPRS的表達及其對胃癌細胞增殖及遷移侵襲能力的影響

劉歆陽 何夢江 陳巍峰 李全林 周平紅△

（1復旦大學附屬中山醫院內鏡中心 上海 200032；2復旦大學附屬中山廈門醫院內鏡中心 廈門 361015）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居所有惡性腫瘤的第四位，病死率位居第二位［1］。我國是胃癌的高發國家之一，發病數占全球42%［2］。胃癌的治療主要采取以外科手術切除為主的綜合治療手段［3］，傳統的治療（包括手術、放療及化療）在早期胃癌的治療上取得了一定進展，但對于診斷時已處于進展期、伴有深度浸潤或淋巴結轉移的胃癌患者，即使行根治性切除術，仍有40%～65%在術后發生復發或轉移，而復發轉移后放療效果欠佳，生存時間較少超過一年，成為限制胃癌術后生存率的最關鍵因素。因此，探究胃癌的轉移機制、鑒定針對性的治療靶點迫在眉睫，具有重要的臨床價值和社會意義，也是提高胃癌療效的關鍵。

蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）的生物學功能是催化蛋白質的酪氨酸殘基上的磷酸基團轉移到三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）上，從而決定蛋白質的活化與否，影響生物學行為［4］。受體型酪氨酸磷酸 酶S（protein tyrosine phosphatase receptor S，PTPRS）作為PTP家族的重要分子，既往研究集中在神經發育［5］和自身免疫疾病［6］中。近年來PTPRS在腫瘤領域中的作用和機制也受到越來越多的關注，但PTPRS在胃癌中的作用及機制目前尚未見報道。本研究通過分析PTPRS與胃癌患者預后的關系，觀察PTPRS對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探討其機制，從而為胃癌治療新靶點的探索提供理論基礎及實驗依據。

材料和方法

實驗材料PTPRS抗體、EMT相關通路抗體和HRP-標記二抗等購自美國Abcam、Cell Signaling Technology及Sigma公司。PTPRS（兔多抗，Novus，貨號NBP2-92999，WB濃度1∶1 000；兔多抗，Abcam，貨號ab222798，IHC濃度1∶100）；Actin（小鼠單抗，Sigma，貨號A5441，WB濃度1∶2 000）；N-cadherin（兔單抗，Abcam，貨號ab76011，WB濃度1∶1 000）；ASMA（兔單抗，Abcam，貨號ab184705，WB濃度1∶500）；Slug（兔多抗，Abcam，貨號ab27568，WB濃度1∶500）；Snail（兔單抗，Cell Signaling，貨號3879，WB濃度1∶200）；Vimentin（兔單抗，Abcam，貨號ab92547，WB濃度1∶500）。PTPRS敲減慢病毒購自漢尹生物科技（上海）有限公司。DMEM培養基、RPMI 1640培養液和胎牛血清均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；熒光定量PCR儀和凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司；相機購自日本Canon公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木素體細胞快速染色液均購自福州邁新生物技術開發有限公司。Transwell小室及Matrigel PTMP Basement Membrane Matrix購自BD biosciences公司。本研究中使用的患者組織標本通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準（B2020-393R），獲得研究對象知情同意。

利用組織芯片分析PTPRS在胃癌的表達情況及與臨床病理因素的關系回顧性收集2013年1月—6月復旦大學附屬中山醫院手術切除的胃癌患者瘤體石蠟標本，并進行切片和HE染色，從組織學層面鑒定細胞形態和排列結構。每個蠟塊均選取2個細胞形態典型，排列結構典型，無制作過程中擠壓、開裂的組織位點，進行打孔排列，制作組織芯片。收集胃癌患者的基本臨床信息（包括年齡、性別等）及相關臨床病理特征（包括腫瘤大小、部位、分化程度等）。將信息錄入Stata 14.0，與組織芯片位點一一對應，PTPRS蛋白進行免疫組化染色，利用ImageJ對組織芯片的照片進行處理，對于染色的深度和細胞的豐富程度等利用IHC Profiler軟件進行打分，根據IHC Profiler分數的高低進行排序，以平均數進行分組，區分PTPRS高表達組和PTPRS低表達組［7］。兩位研究者獨立對于ImageJ評分的結果進行判定，對發現有問題的樣本進行討論，根據討論結果確定高低表達組分類。對分組與胃癌臨床病理特征進行相關性分析，并比較不同表達水平與患者生存及術后復發的相關性。

構建PTPRS干擾的穩轉細胞株本實驗采用的SGC7901和HGC27細胞系來源于復旦大學附屬腫瘤醫院，培養方法為DMEM+10%FBS。ShPTPRS的序列為5’-TACTTGGCACATTCCT-CCTTT-3’。ShRNA載體使用pcDNA 3.1，利用慢病毒包裝試劑盒（吉凱基因，LPK001）在293T細胞中構建PTPRS干擾的慢病毒。在胃癌細胞系中轉染構建好的慢病毒，利用熒光顯微鏡觀察病毒自帶的GFP綠色熒光了解轉染效率，轉染效率＜90%為重復轉染。轉染成功后利用qPCR和驗證PTPRS表達水平變化。

CCK-8法檢測細胞增殖胃癌細胞株使用含10%FBS的培養基；取2 000個/孔（每孔100 μL）的濃度將處于對數期的細胞接種到96孔板，每孔設3個對照；待細胞貼壁后，加入10 μL CCK-8檢測液，溫育2 h；用自動酶標儀在450 nm波長處，測定各孔的吸光度（D）值。連測5天，最后取各樣本的平均值進行比較。

平板克隆形成實驗將胃癌細胞株常規消化重懸為細胞懸液，密度調整至每毫升250個；在六孔板中，每孔加入2 mL細胞懸液，每種細胞設置3個平行孔；放入37℃培養箱中培養10～14天，3～5天更換一次新鮮培養基。每孔加入4%多聚甲醛30 min，用1.0%～1.5%結晶紫染色10～20 min，洗滌晾干后用1 mL無菌水溶解，自動酶標儀在450 nm波長處測定各組的吸光度值，獨立實驗重復3次。

劃痕實驗檢測細胞遷移能力在六孔板中接種5×105個胃癌細胞。在第二天細胞鋪滿后，用槍頭比著直尺，垂直于平面劃除細胞，PBS清洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。將六孔板放入CO2培養箱中，于0、6、12、24、48、72 h在同一位置進行拍照和比較分析。采用ImageJ對同一視野不同時間照片的無細胞區域進行圈套和面積計算。0 h無細胞區域的面積為A cm3，48 h無細胞區域的面積為B cm3，細胞遷移的面積比例為（A-B）/A。

Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力準備Transwell小室，按照每100μL無血清培養基含1×105胃癌細胞接種于上室，下室的培養基加入20%血清，培養6 h后顯微鏡下計數濾膜下表面的細胞數量，即遷移實驗。用鋪好100 μL Matrigel的小室重復，即侵襲實驗。下室拍照后圖片按照水平正中線和垂直正中線分割為4個象限，兩名研究者在4個象限中通過放大的圖片進行獨立的細胞計數，計數一致后，4個象限的細胞數量取平均值。每個對照組和實驗組實驗重復3次。

RNA提取、反轉錄及熒光定量qPCR使用Trizol法提取組織及細胞的mRNA，并利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit（RR047A）進行。定量qPCR的引物如下：PTPRS的引物（正向：5’-CAAAGAACCCAAGGACCAGAT-3’；反向：5’-CTCATCAAACTCAATCGTCTCA-3’），PCR產物長度為148 bp，溶解溫度為60℃。GAPDH的 引 物（正 向：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；反向：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’），PCR產物長度為450 bp，溶解溫度為58℃。使用Takara公司的TB Green Fast qPCR Mix（RR430S）試劑盒進行定量qPCR。

Western blot法檢測蛋白表達細胞收集后加入RIPA裂解液常規方法提取細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30～50 μg蛋白質，行10%～15%SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，4℃、100 V轉移100 min至0.45 μm PVDF膜 上。PVDF膜 用 含5%～10%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h后，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1.5 h，洗膜后加入顯色液常規顯像。

統計學方法采用Stata 14.0和Prism 6.0統計軟件對數據進行統計學分析，所有實驗數據均用±s或%表示，兩組均數的比較采用t檢驗，配對資料兩組均數比較采用配對t檢驗，計數變量比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan Meier分析及Cox比例風險回歸。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

PTPRS在胃癌中低表達且與不良預后相關我們收集了141例胃癌患者癌組織進行免疫組織化學染色，患者中男性為76.6%，中位年齡為（59.40±10.60）歲。將患者按PTPRS表達水平分為低表達組（圖1A）和高表達組（圖1B），其中低表達組55例，高表達組86例，結果顯示PTPRS低表達與不良分化（P=0.012）及神經浸潤（P=0.036）密切相關（表1）。進一步生存分析顯示，PTPRS低表達是胃癌患者復發時間（log rankP=0.040，圖1C）及生存時間（log rankP=0.009，圖1D）縮短的重要預測因素。多因素分析顯示校正性別、神經浸潤、T分期、N分期、M分期等單因素分析中P＜0.2的危險因素后，PTPRS低表達對預后的影響仍有統計學意義（P=0.021，表2）。對10對胃癌患者的癌組織和癌旁組織進行qPCR檢測，配對檢驗發現癌組織與癌旁組織相比PTPRS表達量顯著降低（P=0.011，圖1E）。對胃癌細胞系及正常胃黏膜細胞系的qPCR檢測顯示，與正常胃黏膜細胞系GES-1相比，胃癌細胞系中PTPRS普遍低表達（圖1F）。選取表達量相對較高且體內成瘤性較強的SGC7901及HGC27兩種細胞系進行進一步功能實驗。

表1 PTPRS不同表達水平胃癌患者臨床病理因素差異Tab 1 Clinicopathological characteristics of gastric cancer patients in different PTPRS expression subgroups［n（%）］

表2 胃癌患者總生存時間的單因素及多因素分析Tab 2 Univariate and multivariate analysis of factors associated with overall survival in gastric cancer patients

圖1 PTPRS在胃癌中低表達且與不良預后相關Fig 1 PTPRS is low expressed in gastric cancer and is closely related to poor prognosis

PTPRS低表達促進胃癌增殖在SGC7901及HGC27兩種細胞系中用慢病毒轉染構建PTPRS干擾的穩轉株，qPCR驗證干擾效率（圖2A，2B）。CCK-8實驗發現，PTPRS低表達顯著促進胃癌細胞的生長速度（圖2C，2D），與HGC27 GFP組和SGC7901 GFP組 相 比，HGC27PTPRSsh和SGC7901PTPRSsh組的細胞生長速度明顯增加（HGC27組：Pd1=0.012，Pd2=0.008，Pd3=0.003，Pd4=0.003，Pd5=0.026；SGC7901組：Pd1＜0.001，Pd2=0.005，Pd3＜0.001，Pd4＜0.001，Pd5＜0.001）；克隆形成實驗表明，HGC27PTPRSsh和SGC7901PTPRSsh組形成的克隆數明顯多于HGC27 GFP組和SGC7901 GFP組（圖2E，2F），差異有統計學意義（P均＜0.001）。提示PTPRS低表達促進胃癌細胞增殖。

圖2 PTPRS低表達促進胃癌細胞增殖Fig 2 Low expression of PTPRS promoted proliferation of gastric cancer cells

PTPRS低表達促進胃癌細胞遷移侵襲在PTPRS干擾的穩轉株中，劃痕實驗表明，與HGC27 GFP組、SGC7901 GFP組相比，HGC27PTPRSsh和SGC7901PTPRSsh組的細胞劃痕修復能力明顯增強（圖3A，3B），差異有統計學意義（HGC27組：P=0.002；SGC7901組：P=0.022）。Transwell遷 移實驗表明，與HGC27 GFP組和SGC7901 GFP組相比，HGC27PTPRSsh組和SGC7901PTPRSsh組胃癌細胞遷移到下層小室的數目明顯增加（圖3C、3D；HGC27組：P=0.012；SGC7901組：P＜0.001）。Transwell侵襲實驗中結果相似，HGC27PTPRSsh組和PTPRSsh組胃癌細胞遷移到下層小室的數目明顯多于HGC27 GFP組和SGC7901 GFP組（圖3C、3D；HGC27組：P=0.004；SGC7901組：P=0.008），表明PTPRS低表達促進胃癌細胞遷移侵襲。

圖3 PTPRS低表達促進胃癌細胞遷移侵襲Fig 3 Low expression of PTPRS promoted migration and invasion of gastric cancer cells

PTPRS低表達對EMT的影響觀察HGC 27和SGC 7901兩種細胞干擾PTPRS后細胞形態的變化，發現PTPRS干擾后細胞出現輕微的梭形改變（圖4A），在HGC 27細胞中更加明顯。對于PTPRS干擾的胃癌細胞系進行EMT相關蛋白的檢測，發現PTPRS干擾后細胞N-cad、ASMA表達增加，但E-cad變化不明顯。Slug有增加趨勢，Snail及Vimentin變化不明顯（圖4B）。提示PTPRS低表達可能通過促進EMT從而促進胃癌細胞遷移侵襲。

圖4 PTPRS干擾對胃癌細胞系中EMT的影響Fig 4 Effect of PTPRS interference on gastric cancer cell lines

討 論

蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）的生物學功能是催化ATP的γ磷酸基轉移到蛋白質的酪氨酸殘基上，或催化蛋白質的酪氨酸殘基上的磷酸基團轉移到ATP上，從而決定蛋白質的活化與否，影響生物學行為［4］。PTK在腫瘤發生發展中的作用重要、機制清晰，多個針對PTK的單克隆抗體和小分子抑制劑已經應用于臨床［8］。PTP的發現雖然比PTK滯后，但近年來隨著研究不斷深入，多種PTP家族成員的在腫瘤中的功能得到證實，下游機制也逐漸清晰。例如PTPRT啟動子區域的高甲基化抑制PTPRT表達，異常激活下游STAT3通路，是非小細胞肺癌靶向治療耐藥的關鍵機制［9］。非受體型酪氨酸磷酸酶3（protein tyrosine phosphatase non receptor 3，PTPN3）的激活性突變是肝內膽管細胞癌持續增殖和侵襲轉移的關鍵致病基因［10-11］。隨著對PTP的生物學功能和作用機制的研究逐漸深入，PTP成為繼PTK之后重要的腫瘤靶向治療開發位點［12］。PTPRS參與神經系統發育，并在免疫調節、細胞自噬等過程中發揮重要作用，在腫瘤中的作用也受到越來越多的關注，24%的頭頸腫瘤患者PTPRS缺失，是其靶向治療耐藥的關鍵因素之一［13］。PTPRS調控ERK的異常激活及其核質分布失衡對結直腸癌的增殖起到重要的促進作用［14］。78%的肝細胞肝癌中PTPRS的表達水平降低，且PTPRS的低表達與肝癌的惡性臨床表型顯著相關，是肝癌患者生存和復發的獨立危險因素［15］。

相關報道均提示PTPRS可能起到抑制腫瘤發展的作用，但在胃癌中的作用未見報道。為了探索PTPRS在胃癌中的作用，我們首先分析了PTPRS胃癌患者樣本中的表達情況，發現PTPRS低表達與不良分化及神經浸潤密切相關，進一步生存分析顯示PTPRS低表達是胃癌患者生存時間縮短的獨立危險因素。繼而對10對胃癌患者的癌組織和癌旁組織進行配qPCR檢測，發現癌組織與癌旁組織相比PTPRS表達量顯著降低。這些結果提示PTPRS在胃癌中可能也起到抑癌基因的作用。

在SGC7901及HGC27兩種細胞系中用慢病毒轉染構建PTPRS表達干擾的穩轉株，qPCR驗證干擾效率。CCK-8實驗發現，PTPRS低表達顯著促進胃癌細胞的生長，克隆形成實驗表明PTPRS低表達顯著促進胃癌細胞克隆形成能力，劃痕實驗和Transwell實驗表明PTPRS低表達顯著促進胃癌細胞遷移和侵襲能力。我們的體外實驗結果基本與標本檢測結果中預測的結果相符。

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞轉變獲得間質細胞表型的生物學過程，在腫瘤發生中發揮關鍵作用［16］。我們對于PTPRS干擾的胃癌細胞系進行EMT相關蛋白的檢測，發現PTPRS干擾后細胞出現N-cad、ASMA表達增加等表現，提示PTPRS低表達可能通過EMT促進胃癌遷移侵襲。既往在肝癌中發現PTPRS低表達通過EGFR/PI3K/mTOR通路介導EMT［14］，而上皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是介導的EMT過程的關鍵分子。近期在惡性外周神經鞘瘤中發現PTPRS低表達通過上調profilin-1從而激活EMT［17］。在頭頸癌中和肝癌中有報道PTPRS低表達通過靶向STAT3促進腫瘤進展［18-19］。而在結直腸癌中PTPRS可以抑制Erk及其核轉位［20］。由此可見，PTPRS在不同腫瘤中發揮作用所靶向的下游底物存在顯著的異質性，在胃癌中PTPRS發揮抑癌作用的可能通路及潛在下游底物目前仍沒有報道，其具體機制有待進一步的研究。

本研究存在以下不足：第一，由于PTPRS蛋白編碼序列過大（相對分子質量為220 000），超過了慢病毒載體的可包裝大小，無法構建過表達的高效慢病毒載體和細胞模型。質粒轉染效率也因質粒過大，轉染效率不高，因而沒有進一步開展PTPRS過表達的相關功能實驗及機制探究。為了彌補這一不足，在PTPRS干擾模型中，我們利用兩株來源不同的胃癌細胞系進行功能實驗和機制探究。第二，PTPRS對胃癌的影響仍需進一步在體內模型中進行驗證。第三，對于PTPRS在胃癌中發揮生物學作用的具體機制仍需進一步闡明。

綜上所述，PTPRS低表達能夠增強胃癌細胞增殖、遷移和侵襲形成能力，有可能與激活EMT相關，提示PTPRS有可能成為胃癌的潛在治療靶點，但其功能、分子機制和信號轉導通路尚待深入研究。

作者貢獻聲明劉歆陽研究設計，數據整理，統計分析，論文撰寫。何夢江數據整理，論文構思。陳巍峰論文修訂。李全林，周平紅研究設計和指導，論文修訂和審閱。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。