侵襲性真菌感染非培養檢測方法的進展

趙正群，帕麗達·阿布力孜指導老師）

（新疆醫科大學第一附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830000）

0 引言

據估算，全球每年發展為急性侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)的患者有近190萬人，另外約有300萬人患有慢性嚴重真菌感染，估計每年所有與真菌疾病相關的死亡率會超過約160萬[1]。這些感染不僅會造成較高的發病率和死亡率，而且會帶來巨大的經濟負擔，僅在美國，每年的治療費用估計就超過10億美元[2]。IFI診斷的困難不僅可能增加與這些疾病相關的診療費用，而且可能導致更高的死亡率。IFI的死前診斷率約為50%，范圍僅為12%-60%，這取決于IFI的病因和已故患者的潛在疾病類型。這一統計中反映的診斷困難也對抗菌藥的使用和日益增長的抗菌素耐藥性威脅產生了重大影響[3]。因此，有必要改進與IFI診斷和治療相關的管理，以及當前真菌診斷的成本和可及性。

根據歐洲癌癥/侵襲性真菌感染研究和治療合作小組(European Organization for Research and Treatment of Cancer/侵襲性真菌感染合作小組)和美國國家過敏和傳染病研究所真菌病研究組(EORTC/MSG)的規定，目前對IFI確診的定義需要一種微生物學和/或組織病理學診斷方法，但該定義的目的是提供清晰度和一致性，以提高臨床研究的質量。在臨床中，單獨使用這些傳統臨床診斷技術受到所需標本靈敏度低、周轉緩慢和侵入性的限制，而不需在培養中生長或組織中鑒定的實驗室技術(例如真菌抗體、抗原和核酸檢測)在與IFI相關的臨床決策中卻發揮著重要作用。但這些技術在推廣使用、合理利用和臨床性能等方面存在局限性。臨床中及時診斷侵襲性真菌感染很重要，因為早期開始適當的抗真菌治療可以明顯改善患者的預后。這篇綜述是介紹侵襲性真菌感染的非培養檢測方法，以便于早期診斷侵襲性真菌感染。

1 真菌抗原檢測技術

1.1 (1,3)-β-D-葡聚糖檢測（1,3-β-D-glucan ，BDG）

BDG是曲霉屬、念珠菌屬、卡氏肺囊蟲和其他真菌細胞壁的主要成分,而不包括隱球菌屬、芽生菌屬、毛霉菌。由于BDG在維持真菌細胞壁結構中的重要作用，它不僅被作為抗真菌藥物研究的靶點，也成為診斷IFIs的標記物。BDG在真菌感染期間流入體液中，在對IFIs的專門檢測中有一定的臨床效用，尤其是在IFIs流行率低至中等的臨床環境中。已經開發了幾種商業檢測方法，其中對Fungitell檢測方法(Associates of Cape Cod, East Falmouth, MA, USA)的研究最為廣泛，Fungitell檢測方法是美國食品和藥物管理局（the United States Food and Drug Administration ，FDA）批準的輔助診斷侵襲性真菌病的方法。Fungitell檢測方法不直接測量BDG濃度，而是通過顯色法或濁度法測量與BDG結合的馬蹄鱟凝固級聯的激活率去定量BDG的濃度。商業試劑盒使用的試劑來自不同種類的馬蹄鱟，陽性結果的截止值各不相同。Fungitell試驗可以在血培養陽性前幾天至數周內檢測出血清中低至1pg/mL的BDG水平，因此有助于區分有無IFIs的患者。血清BDG測定的準確度為76.8%-80%，特異度為63%-85.3%。連續兩次BDG檢測的陽性結果比用一次測量的陽性結果精度更高。

研究表明除血清外，BALF(Bronchoalveolar Lavage Fluid)和CSF(Cerebrospinal Fluid)中 的BDG檢測可能對IFI的診斷具有重要的臨床意義。如Mikulska等表明BDG檢測在診斷不同的中樞神經系統真菌感染(包括曲霉菌病、組織胞漿菌病和一些隱球菌病)方面是有用的，且Litvintseva等人還證明了在138 pg/mL的臨界值下其對于診斷真菌性腦膜炎的作用，腦脊液BDG檢測的敏感性和特異性分別為100%和98%，這說明對腦脊液樣本進行BDG檢測的研究結果可以輔助診斷IFIs。此外，臨床中也需考慮BDG檢測假陽性的問題，包括念珠菌或霉菌定植、人類血液制品、血液透析或血液濾過、某些革蘭氏陽性菌、某些β-內酰胺類抗生素、纖維素敷料、腸內營養、黏膜炎以及胃腸道完整性的破壞。

1.2 半乳甘露聚糖(aspergillus galactomannan,GM）

半乳甘露聚糖是多種真菌的細胞壁成分，包括曲霉屬、青霉屬、擬青霉屬、淡紫擬青霉和組織胞漿菌。因GM分子中含有的呋喃半乳糖側鏈（the Galf-containing side-chains）不是由人類產生的，故將其作為診斷真菌感染的生物標志物。曲霉屬在入侵生長過程中可以釋放熱穩定的可溶性GM。用EIA（Platelia Aspergillus EIA；Bio-Rad，Marnesla-Coquette，France）檢測GM是診斷侵襲性曲霉病的一種成熟和廣泛研究的方法[4]。單克隆抗體EB-A2用雙夾心ELISA以檢測β-1,5-呋喃半乳糖的抗原側鏈，該側鏈具有帶有α-1,2和α-1,6鍵的甘露聚糖線性核心。多個專家機構強烈建議當懷疑患者有侵襲性真菌感染(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)時，血清GM檢測可用于出現不明原因的肺浸潤的嚴重免疫損害患者[5]。此外，其他的體液中也可檢測到GM，包括支氣管肺泡灌洗液、腦脊液、腹腔液和尿液等。然而，只有血清或血漿、BALF、腦脊液的GM檢測獲得FDA批準，目前用于侵襲性真菌感染的臨床診斷或擬診IA的患者。

血清樣本GM檢測的敏感性和特異性因宿主和使用的截止指數而異。在鄒等人的研究中表明，BALF GM檢測的最佳界值為1.0，其聯合敏感性高于PCR和血清GM檢測，提示BALF GM檢測可作為診斷已確診或擬診IA的有效輔助手段。而在一項回顧性研究中，對15名確診或臨床診斷為中樞神經系統侵襲性霉菌病中的9名兒童患者進行了腦脊液GM檢測，發現5名患者呈陽性結果，表明CSF GM檢測作為可以輔助診斷中樞神經系統侵襲性霉菌病。最后，GM除了作為診斷標記物，還可以很好地預測IA的治療反應和生存期。在臨床的實際應用中也需要考慮假陽性結果，假陽性結果原因可能是與其他真菌的GM有交叉反應性，以及受到某些批次的β-內酰胺抗生素的GM污染（除哌拉西林/他唑巴坦外)。總之，多種臨床標本進行GM檢測可獲得較好的臨床診斷價值，且BALF GM明顯優于血清GM。

1.3 隱球菌抗原檢測（cryptococcal antigen detection，CrAg）

新生隱球菌在以多糖為基礎的細胞壁之外，有一個獨特的光環多糖莢膜，它是隱球菌疾病的診斷標志。隱球菌莢膜主要由GXM、葡聚糖氧基葡萄糖半乳聚糖(glucoronoxylomannogalactan,GXMG al)和微量甘露糖蛋白組成。GXM也是主要的隱球菌多糖莢膜抗原(cryptococcus polysaccharides capsular antigen，CrAg)，在隱球菌疾病傳播的早期過程中大量釋放在血液和腦脊液中。血清和腦脊液的隱球菌基線滴度與真菌組織負荷相對應，因此可作為隱球菌性腦膜炎（cryptococcal meningitis,CM）的預后標志物[6]。目前，檢測CrAg的兩種常用方法是乳膠凝集試驗和酶免疫法，這兩種方法都是FDA批準的商用方法。目前已經擴展到包括一種床旁免疫層析試紙測試，與其他商業上可獲得的CrAg測試相比，該測試在腦脊液、血漿和血清樣本中顯示出與其他商業上可用的CrAg測試相同或更高的靈敏度和特異性的陽性結果。在高發環境下早期針對腦脊液和血液中進行隱球菌的抗原檢測，可更快地達到降低隱球菌相關死亡率的效果。在腦膜炎癥狀出現之前的幾周到幾個月內，可以在血清中檢測到CrAg，因此可以對無癥狀、有發生CM的高風險患者進行前瞻性檢測。此外，在最近的一項回顧性研究中，血清CrAg試驗可用于診斷CM，并可作為HIV感染合并隱球菌抗原血癥患者死亡率的預測因子[7]。到目前為止，CrAg試驗在BALF中的應用仍然是有限的[8]。

1.4 組織胞漿抗原檢測

組織胞漿菌病是另一種IFI，它的抗原檢測通常用于診斷。組織胞漿抗原檢測有多個檢測平臺；MiraVista組織胞漿抗原定量酶免疫分析(MiraVista Diagnostics，Indianapolstics，IN)與IMMY(Norman，OK)生產的用于檢測組織胞漿GM的分析物特異性試劑的比較顯示，使用EIA檢測組織胞漿GM的總體符合率為90%。這項研究是專門針對尿液樣本進行的,最近發表的一篇關于同一患者在一周內完成的尿液和血清抗原配對檢測的綜述顯示，兩種樣本類型的檢測結果有98%的一致性。

1.5 結合分子和抗原檢測

最常用的是GM檢測和曲霉PCR診斷相結合的方法，但與單獨的檢測方法相比，使用率仍然相對較低，該方法使用各種基因靶標(例如，線粒體DNA、28S rRNA、18S rRNA和核糖體DNA，的內部轉錄間隔區來篩查高危患者群體中的IA。

2 真菌檢測的新方法

2.1 T2Candida檢測

念珠菌的淺表感染和侵襲性念珠菌病的診斷已使用直接檢測試驗。最近，FDA批準了第一個直接檢測念珠菌核酸的測試(T2 Candida；T2 Biossystems，Inc.，Lexington，MA)。該方法結合靶向PCR和T2磁共振技術，能夠直接從血液標本中檢測出5種最常見的念珠菌，與血液培養相比，其總體特異性為99.4%(95%CI，99.1%-99.6%)，總體 敏 感 性 為91.1%(95%CI，86.9%-94.2%)。這 些發現在一項研究中得到了很大程度的證實，該研究使用了念珠菌血癥患者的樣本，其臨床敏感度為89%[9]。這項研究的結果，與最初的臨床試驗結果相結合，表明無論流行率如何，陰性預測值始終很高(98%-99.9%)，但T2Candida的陽性預測值差別很大，這取決于代表的患者群體的預期流行率(15%-92%)[9]。

2.2 揮發性有機化合物(volatile organic compounds VOCs)

研究人員使用生物引導的方法識別生物標記物后，對64名疑似IFIs患者的呼吸樣本進行了測試,研究人員發現，根據EORTC/MSG共識標準，與確診和臨床診斷IA參考標準相比，檢測特定4-代謝物特征的任何元素可以區分IA患者和非IA患者，其靈敏度為94%(95%CI，81%-98%)，特異性為93%(95%CI，9%-98%)。然而其他的研究發現，在體外，從臨床標本中培養分離的曲霉菌的揮發性有機化合物譜并不總是在同一患者的呼吸中可以被檢測到[10]。Koo和他的同事提供了一個有趣的證據，支持直接檢測外源真菌代謝物用于IA診斷的潛在用途。

2.3 質譜法（mass spectrometry-disaccharide，Ms-Ds）

在為IA確定新的生物標志物的類似主題中，研究人員最近利用質譜法，不僅用于培養鑒定中分離的真菌，而且還用于檢測患者血清中循環的真菌分子。Senhad等人描述了一種檢測和相對定量泛真菌血清二糖(disaccharide,DS)的方法，該方法隨后被證明與用于IFIs診斷的商用BDG和GM檢測方法具有可比性。

2.4 側向流動免疫診斷裝置

研究人員在試紙形式的側向流動免疫診斷裝置中使用了一種新型的半乳呋喃糖特異性抗煙曲霉單克隆抗體，以證明檢測尿樣對IA的診斷是敏感和特異的。該檢測方法的靈敏度因患者群體的不同而不同。例如，在所有確診/臨床診斷IA的 患 者 中，敏 感 度 為80%(95%CI，61.4%-92.3%)，但在血液系統惡性腫瘤、骨髓移植或中性粒細胞減少癥患者(n=50)和非癌癥患者(n=75)中的敏感度分別為89.5%(95%CI，66.7%-98.7%)和63.6%(95%CI，30.8%-89.1%)，而 非 癌 癥 患 者的敏 感 度分 別 為89.5%(95%CI，66.7%-98.7%)和63.6%(95%CI，30.8%-89.1%[11])。在54項 研 究 的回顧中，發現該方法的敏感度為61%-82%之間，特異度為81%-93%。

2.5 流式細胞術

新的真菌檢測方法可以通過促進對確診的IFIs患者的監測來幫助指導適當的抗真菌藥物的使用。例如，隱球菌性腦膜炎患者的腦脊液真菌負荷是死亡率的重要決定因素，可用于指導治療。從歷史上看，量化培養一直被用來進行這種評估。流式細胞術測量的隱球菌計數與定量培養和CrAg滴度有很強的相關性，表明這項技術可以用來快速和準確地測量HIV相關隱球菌性腦膜炎患者的真菌負荷[12]。

3 小結

盡管侵襲性真菌感染的非培養診斷方法前景較好，但目前還沒有任何檢測方法能降低死亡率和發病率,以及縮短住院時間，或抑制抗真菌耐藥性的出現[13]。臨床中應充分了解每種實驗室檢測方法的優缺點及檢測性能，可以更好地幫助診斷侵襲性真菌感染。將傳染的檢測方法與抗原檢測方法、PCR技術、新的檢測方法聯合應用可顯著提高侵襲性真菌感染的檢測靈敏度，從而改善患者的預后。