α-酮戊二酸分離提取工藝的優(yōu)化

楊雪晨，付紹平，王麗霞，徐寧，徐超，劉光輝，馬振平，劉君*

1(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300000)2(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308)

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)作為二元羧酸，在生物體碳氮代謝中扮演重要角色，對(duì)糖、氨基酸和蛋白質(zhì)的合成也有重要作用[1-5]。α-KG同時(shí)還具有抗衰老的作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)[6-7]。傳統(tǒng)工業(yè)采用化學(xué)合成法生產(chǎn)α-KG[8]，使用大量化學(xué)試劑，嚴(yán)重污染環(huán)境。微生物發(fā)酵法存在副產(chǎn)物過多，發(fā)酵周期長(zhǎng)等弊端。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法具有催化反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)副產(chǎn)物少，產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，適合α-KG的分離提純。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系存在殘留底物、雜蛋白、有機(jī)雜酸和色素等雜質(zhì)，且α-KG的親水性強(qiáng)、溶解度大，為后續(xù)的分離提純帶來困難。因此，高效率的轉(zhuǎn)化技術(shù)和合理的分離提純方法是生產(chǎn)α-KG的關(guān)鍵。

彭小雨等[11]發(fā)現(xiàn)鈣鹽沉淀法可以從含大量酮酸的發(fā)酵液中分離提純?chǔ)?KG，王東陽(yáng)等[12]發(fā)現(xiàn)Ca(OH)2作為中和劑會(huì)使發(fā)酵液中的α-KG鈣鹽沉淀反應(yīng)進(jìn)行的更穩(wěn)定。也有較多文獻(xiàn)報(bào)道了離子交換法對(duì)有機(jī)酸的提取，如李寅等[13]采用離子交換法從發(fā)酵液中提取丙酮酸，占宏德等[14]采用離子交換法從發(fā)酵液中提取了α-KG。本文使用全細(xì)胞催化法生產(chǎn)α-KG[15]，應(yīng)用鈣鹽沉淀法作為分離提純?chǔ)?KG的預(yù)處理步驟。α-KG鈣鹽的酸解過程具有不可逆的特點(diǎn)，但是酸解后的液體依然會(huì)含有少量的CaSO4、Ca(OH)2、α-KG鈣鹽等殘留。離子交換法具有提取效率高，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[16]，并且可以去除酸解液中的鈣鹽雜質(zhì)。本文使用離子交換法對(duì)鈣鹽沉淀法處理后的料液進(jìn)行更進(jìn)一步的分離提純，采用動(dòng)態(tài)吸附以及兩階段洗脫對(duì)α-KG鈣HCl水解液進(jìn)行純化，對(duì)2種α-KG的分離方法進(jìn)行結(jié)合，以期為α-KG轉(zhuǎn)化液的分離純化提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：DHG-9023A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠公司；SX-500滅菌鍋，馭锘實(shí)業(yè)有限公司；有機(jī)玻璃型φ2.5 cm×45 cm離子交換層析柱，上海廈美生化科技發(fā)展有限公司；YRE-2010Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Avanti J-26S XP落地式高速冷凍離心機(jī)，上海納锘實(shí)業(yè)公司；AL104-IC電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；1260 InfinityⅡ高效液相色譜，Agilent公司；MOF205中空纖維膜，天津膜天膜科技股份有限公司；ZJSP-11-025型10 kDa納濾膜，Merck Millipore公司。

試劑：離子交換樹脂D380、D301、D113、D201、719、732、717、296R，寧波爭(zhēng)光樹脂有限公司；α-KG轉(zhuǎn)化液，實(shí)驗(yàn)室制備(發(fā)酵菌株：CgL0)；食品級(jí)活性炭，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；α-KG標(biāo)品試劑，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-KG全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液預(yù)處理

轉(zhuǎn)化液預(yù)處理：大型冷凍離心機(jī)5 500 r/min離心后收取α-KG上清液，中空纖維膜過濾除固形物，10 kDa納濾膜除去大部分雜蛋白，再通過活性炭進(jìn)行脫色，最后用HCl溶液調(diào)節(jié)母液pH=2.0，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的母液。

1.2.2 鈣鹽沉淀法粗分離α-KG

選取Ca(OH)2做沉淀劑，將母液pH調(diào)節(jié)至2.0后和過量的沉淀劑放入燒杯攪拌，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的Ca(OH)2調(diào)節(jié)溶液pH=8.0，使Ca(OH)2過量，保證α-KG與Ca(OH)2中和反應(yīng)完全。靜置一段時(shí)間后抽濾收集α-KG鈣鹽沉淀，量取濾液體積，收集中和后的鈣鹽，檢測(cè)濾液中α-KG的含量。將收集到的α-KG鈣沉淀加5 mmol/L H2SO4重懸，再用濃H2SO4調(diào)節(jié)溶液pH至1.0，抽濾收集酸解液，HPLC儀檢測(cè)酸解液中α-KG的含量和純度。

1.2.3 離子交換樹脂的預(yù)處理

陰離子樹脂預(yù)處理步驟：第一步，配制飽和NaCl溶液，取其量約等于被處理樹脂體積的3倍，將樹脂置于其中浸泡24 h，用去離子水漂洗，使排出的水不帶有黃色為止。第二步，配制5%(體積分?jǐn)?shù))HCl溶液，取其量約等于被處理樹脂體積的3倍，將樹脂置于其中浸泡8 h(或作小容量清洗)，用純水漂洗至中性。第三步，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH溶液，取其量約等于被處理樹脂體積的3倍，將樹脂置于其中浸泡8 h，用純水漂洗至中性。

1.2.4 最佳樹脂選型

對(duì)6種樹脂做靜態(tài)離子交換試驗(yàn)，選擇吸附和洗脫效果較好的樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用去離子水水洗抽濾得到46 g抽干濕樹脂，放入250 mL的三角瓶?jī)?nèi)并加入一定濃度的α-KG標(biāo)準(zhǔn)品溶液(每組2個(gè)平行)，室溫下靜置吸附處理26 h。吸附液取樣后用去離子水水洗抽濾，得到吸附后的樹脂濕重，取其中的40 g抽干濕樹脂加入2倍的洗脫劑洗脫26 h，取樣使用比色法檢測(cè)并根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算樹脂平衡時(shí)α-KG的吸附率和洗脫率。

(1)

(2)

式中：A，樹脂吸附率，%；E，樹脂洗脫率，%；ρ0，原液中α-KG質(zhì)量濃度，g/L；ρ1，吸附剩余液中α-KG質(zhì)量濃度，g/L；ρ2，洗柱液中的α-KG質(zhì)量濃度，g/L；ρ3，洗脫液中的α-KG質(zhì)量濃度，g/L；V0，原液中α-KG體積，mL；V1，吸附剩余液中α-KG體積，mL；V2，洗柱液中α-KG體積，mL；V3，洗脫液中的α-KG體積，mL。

1.2.5 洗脫劑的選擇

配制70 g/L的α-KG標(biāo)準(zhǔn)液記為溶液1，取110 g(D301)抽干濕樹脂，加入適量溶液1靜置過夜吸附，抽濾吸附液并用去離子水沖洗3個(gè)柱體積，取吸附后的抽干濕樹脂50 g并分裝于5個(gè)100 mL的三角瓶(每組2個(gè)平行)，加入1%、2%、3%、4%、5%HCl或NaOH(質(zhì)量分?jǐn)?shù))梯度的溶液各30 mL作為洗脫液靜態(tài)洗脫24 h。通過不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)洗脫劑的洗脫效率來決定最佳的洗脫劑和洗脫劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.6 固定床動(dòng)態(tài)吸附與洗脫

離子交換柱采用玻璃層析柱(內(nèi)徑5.2 cm，外徑7 cm，高44 cm)，樹脂裝填量為100 mL。將預(yù)處理過的發(fā)酵液進(jìn)行上樣，待樹脂吸附飽和后，用純水洗去柱中殘留的轉(zhuǎn)化液，然后用洗脫液進(jìn)行洗脫。經(jīng)過3次獨(dú)立試驗(yàn)后，采取等度洗脫策略，分別收集流出液、洗脫液，測(cè)定其中α-KG含量，分析α-KG的吸附效率和洗脫效率，對(duì)動(dòng)態(tài)上樣和動(dòng)態(tài)洗脫進(jìn)行優(yōu)化，找到最優(yōu)的離子交換工藝參數(shù)。

1.2.7 分析檢測(cè)方法

對(duì)實(shí)際樣品的分離純化需要準(zhǔn)確定量以及對(duì)純度進(jìn)行分析，本文選擇HPLC法作為主要的檢測(cè)方式[1]，將待測(cè)樣品稀釋一定倍數(shù)，0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4溶液，用0.22 μm孔徑的微濾膜抽濾并脫氣。HPLC條件：Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫65 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流量0.6 mL/min，檢測(cè)器紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣鹽沉淀法提純?chǔ)?KG

根據(jù)彭小雨[11]的研究結(jié)果可知CaCO3作為沉淀劑，α-KG的收率和純度相對(duì)較高，但是選擇CaCO3作為沉淀劑需要高溫水浴除CO2，而CaCl2在中和時(shí)會(huì)使Cl-富集不利于后續(xù)的離子交換。Ca(OH)2作為沉淀劑縮短了中和時(shí)間，并且中和時(shí)無大量氣體逸出、提高了設(shè)備利用率[17]，本文在進(jìn)一步試驗(yàn)后選擇了Ca(OH)2作為鈣鹽沉淀法預(yù)處理α-KG的沉淀劑，進(jìn)行工藝開發(fā)。由圖1-a和圖1-b可知，α-KG在中和濾液中的含量明顯降低，同時(shí)不同雜質(zhì)HPLC的相對(duì)峰面積占比增加，說明大部分雜質(zhì)并沒有參與中和階段形成鈣鹽的反應(yīng)。由此可知α-KG與鈣離子的結(jié)合具有顯著特異性，中和階段α-KG母液與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生α-KG沉淀的過程有明顯的分離提純效果。

a-α-KG轉(zhuǎn)化液稀釋100倍；b-中和階段濾液稀釋10倍：c-酸解液稀釋100倍圖1 鈣鹽沉淀法各階段HPLC檢測(cè)峰圖Fig.1 Peak diagram of HPLC detection in each stage of calcium salt method

酸解過程利用了α-KG鈣在酸性條件下的解離常數(shù)隨著H+濃度的增高而增大的特性，在H2SO4存在的溶液中發(fā)生反應(yīng)，生成難溶于水的CaSO4沉淀，鈣鹽中的α-KG游離出來進(jìn)入酸解液中。此反應(yīng)屬于不可逆反應(yīng)，因此H2SO4和α-KG鈣可以完全分解為α-KG和CaSO4。圖1-a和圖1-c表征了酸解后α-KG轉(zhuǎn)化液純度的提高，鈣鹽沉淀階段的α-KG收率為85.87%，α-KG的純度從78.79%提升至93.66%。但鈣鹽沉淀法在去除大量雜質(zhì)的同時(shí)，酸解液中也引入了未反應(yīng)完全的Ca(OH)2以及微溶于水中的CaSO4等鈣鹽雜質(zhì)，本文選擇通過離子交換法進(jìn)一步除雜。

2.2 離子交換樹脂篩選實(shí)驗(yàn)

采用靜態(tài)吸附和洗脫實(shí)驗(yàn)對(duì)D380、D301、D201、719、296R、717等6種陰離子交換樹脂內(nèi)進(jìn)行選型。6種樹脂對(duì)α-KG的吸附率和洗脫率結(jié)果如表1所示。

表1 樹脂的吸附和洗脫效果Table 1 Effects of adsorption and elution of resin

弱堿大孔型樹脂D301和D380對(duì)α-KG均有較強(qiáng)的吸附能力，但D301吸附α-KG的效果更好，也更容易洗脫，選擇D301作為后續(xù)離子交換工藝開發(fā)的填料。

2.3 洗脫劑的篩選試驗(yàn)

通過靜態(tài)離子交換洗脫試驗(yàn)，比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH和HCl的洗脫α-KG樣品的效果，選取最合適的洗脫劑。洗脫效果如表2和圖2所示，可以看到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH靜態(tài)洗脫率接近90%，本文選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH作為洗脫劑進(jìn)行后續(xù)離子交換實(shí)驗(yàn)。當(dāng)HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)洗脫率僅為9.47%，且將洗脫液收集后進(jìn)行旋蒸，蒸干水分后得到黃色透明膠狀的固體雜質(zhì)，難溶于水和有機(jī)溶劑。后續(xù)選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的HCl進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集的樣品旋蒸后依然出現(xiàn)該物質(zhì)。所以本文設(shè)計(jì)了一個(gè)離子交換前置洗脫實(shí)驗(yàn)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的HCl除去部分雜質(zhì)同時(shí)盡量減少α-KG損失。

表2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)洗脫劑的洗脫效率檢測(cè)Table 2 Elution efficiency tests with different mass concentrations of eluent

α-HCl洗脫；b-NaOH溶液洗脫圖2 不同洗脫劑的洗脫效果Fig.2 Elution effects of different eluents

后續(xù)再使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH充分洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，與此同時(shí)樹脂經(jīng)過酸洗和堿洗在分離目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)也間接進(jìn)行了再生，固定樹脂床經(jīng)去離子水沖洗3倍柱體積后能再次投入使用。該方法簡(jiǎn)化了樹脂再生流程，提高了生產(chǎn)效率和洗脫液中α-KG的純度。

2.4 動(dòng)態(tài)上樣條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響

如圖3所示，雖然不同質(zhì)量濃度的上樣流出曲線的總體趨勢(shì)相似，但是在上樣質(zhì)量濃度為10和21 g/L的時(shí)候流出曲線拉平明顯，而上樣質(zhì)量濃度為43 g/L時(shí)穿透點(diǎn)提前，不利于樹脂床均勻地吸附。造成這些現(xiàn)象的主要原因可能是因?yàn)橹芋w積較小，吸附容量有限所致。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，選擇31 g/L作為α-KG的上樣質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)上樣優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同上樣質(zhì)量濃度流出曲線Fig.3 Outflow curves for different loading concentrations

2.4.2 動(dòng)態(tài)吸附上樣流速對(duì)流出曲線的影響

動(dòng)態(tài)離子交換有一個(gè)重要的上樣參數(shù)，料液流經(jīng)已知體積的固定樹脂床所用的時(shí)間，即每小時(shí)流經(jīng)柱子的上樣液為床體積(bed volume,BV)的倍數(shù)，常用BV/h表示[18]。

高效的離子交換必須使固液兩相有充分的接觸時(shí)間，如果液相流速增加，固液接觸時(shí)間縮短，樹脂與上樣液來不及交換，就會(huì)導(dǎo)致交換區(qū)間拉長(zhǎng)發(fā)生滲漏現(xiàn)象[19]。由圖4可知，在以8 BV/h的流速上樣時(shí)曲線拉平展開，而以4 BV/h和6 BV/h的流速上樣使穿透點(diǎn)提前，這都不利于樹脂的有效利用，造成上料的浪費(fèi)，使生產(chǎn)成本進(jìn)一步提高。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，選擇比較低的2.4 BV/h的流速作為上樣流速比較合理。

圖4 不同上樣流速的流出曲線Fig.4 Outflow curves for different loading flow rates

2.4.3 樹脂床裝填量高徑比對(duì)流出曲線的影響

在高徑比不同的條件下進(jìn)行上樣，得到流出曲線(圖5)。

圖5 不同高徑比的流出曲線Fig.5 Outflow curves for different height to diameter ratios

分析流出曲線發(fā)現(xiàn)，不同的高徑比對(duì)流出曲線變化趨勢(shì)的影響較大。當(dāng)高徑比為10∶1時(shí)，流出曲線坡度相對(duì)較緩，交換區(qū)域相對(duì)拉長(zhǎng)造成吸附效率降低。高徑比為5∶1時(shí)，曲線出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，可能是由于隨著上樣進(jìn)行樹脂吸附容量降低，當(dāng)交換區(qū)間拉的過長(zhǎng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致吸附能力減弱使曲線出現(xiàn)拖尾，還可能是由于樹脂裝填不嚴(yán)實(shí)所致。故在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)選擇2.5∶1的高徑比，吸附效率提高，有利于研究可以較好地進(jìn)行。

2.5 動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.5.1 第一階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的HCl洗脫

上樣后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%等度洗脫2個(gè)柱體積，每10 mL取一次樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)，當(dāng)取到350 mL樣品時(shí)停止。經(jīng)過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)收集到的樣品中α-KG含量很低不到母液的1%，α-KG的損失幾乎可以忽略。此步驟除去了一部分母液中的雜質(zhì)，使料液純度進(jìn)一步提升，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

2.5.2 第二階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH洗脫

通過第一階段的洗脫分離提純，第二階段本文使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH作為洗脫劑洗脫產(chǎn)物。觀察不同流速的動(dòng)態(tài)洗脫曲線，判斷出最佳的洗脫流速，流出曲線如圖6所示。洗脫流速在3.4 BV/h和5 BV/h時(shí)雖然出峰時(shí)間早，但是洗脫峰較小收率低。高流速的洗脫可能使固液兩相接觸時(shí)間不足導(dǎo)致洗脫效率低，當(dāng)洗脫流速在2 BV/h的時(shí)候洗脫峰較大且集中，收率較高，洗脫曲線拖尾不明顯，本文選擇2 BV/h的流速為最佳動(dòng)態(tài)洗脫流速條件。

圖6 不同流速動(dòng)態(tài)洗脫流出曲線Fig.6 Dynamic elution outflow curves for different flow rates

由圖7可知，以5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaOH溶液做洗脫劑，用2 BV/h的流速進(jìn)行等度洗脫，最終料液的純度為97.32%。鈣鹽沉淀法和離子交換法結(jié)合的純化工藝總收率可以達(dá)到80.32%。

圖7 洗脫液HPLC檢測(cè)圖Fig.7 HPLC detection of the collected sample

3 結(jié)論與討論

目前，單獨(dú)使用離子交換法或鈣鹽沉淀法無法得到高純度的α-KG，若想提升α-KG的品質(zhì)，需采用一系列物理化學(xué)的組合方法進(jìn)行分離提純[20]。通過鈣鹽沉淀法，使轉(zhuǎn)化液中的α-KG和Ca(OH)2進(jìn)行中和反應(yīng)，形成α-KG鈣沉淀下來。在此過程中去除了中和濾液中的大量雜質(zhì)，α-KG鈣酸解后得到雜離子含量較少的α-KG酸解液。將鈣鹽沉淀法處理后的α-KG酸解液動(dòng)態(tài)上樣到D301樹脂柱，去除鈣鹽沉淀法中引入的鈣鹽雜質(zhì)，經(jīng)過兩階段洗脫得到純凈的α-KG溶液。最終，α-KG的總收率可達(dá)80.32%，轉(zhuǎn)化液中α-KG的純度從78.79%提升至97.32%，為α-KG生物轉(zhuǎn)化液的精細(xì)分離提供了可行方法。該工藝對(duì)比已報(bào)道過的鈣鹽沉淀法和離子交換法等分離提取方法，可以獲得更高純度的α-KG。使用經(jīng)鈣鹽沉淀法去除大量雜質(zhì)的酸解液進(jìn)行離子交換，對(duì)比用轉(zhuǎn)化液或者發(fā)酵液直接進(jìn)行D301樹脂的上樣吸附，離子交換過程的洗脫效率得到明顯提升，并進(jìn)一步提高了分離后的α-KG純度，適合工業(yè)化發(fā)展的需求。

雖然該工藝對(duì)α-KG的純化效果明顯、收率較高，但后續(xù)如果想進(jìn)一步提高純度以滿足工業(yè)化的需求，需要設(shè)計(jì)α-KG陽(yáng)離子樹脂脫鹽和重結(jié)晶工藝。目前嘗試過的陽(yáng)離子樹脂分別為732、D001-X7、D113、D108，其中D113樹脂的脫鹽能力較好，后續(xù)會(huì)對(duì)該樹脂的脫鹽工藝進(jìn)一步優(yōu)化。經(jīng)過陽(yáng)離子樹脂脫鹽后，再添加有機(jī)溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，可進(jìn)一步提升純度。