植物甾醇納米粒降低高膽固醇HepG2細胞內膽固醇的作用效果研究

焦文佳，石劍夫，黃志芬，陳穎怡，祝愛俠，王春維,5

（1．廣東省食品工業公共實驗室，廣東廣州 511442；2．廣東省食品工業研究所有限公司，廣東廣州 511442；3．廣東省食品質量監督檢驗站，廣東廣州 511442；4.武漢輕工大學 動物科學與營養工程學院，湖北武漢 430023；5.國家糧食局糧油資源綜合開發工程技術研究中心，湖北武漢 430023）

植物甾醇是一類以環戊烷全氫菲為骨架的醇類化合物，是構成植物細胞膜的活性成分之一，其中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇等是最常見的天然植物甾醇[1]。此外，植物甾醇與膽固醇兩者結構類似，主要骨架均為環戊烷全氧菲（甾核），是四環三萜類化合物，屬于無甲基甾醇，手性結構相同。近年來，植物甾醇成為食品熱門營養元素之一，被科學家們譽為“生命的鑰匙”，具有許多十分重要的生理功效，如降低膽固醇、抗炎、抗氧化和抗癌等作用[2]。當人體攝入過多的膽固醇時，肝臟等器官自動調節膽固醇的吸收和排泄的功能會發生障礙，多余的膽固醇不能正常排出體外，會導致血清中膽固醇升高，造成高膽固醇血癥或高血脂癥[2]。人體攝入植物甾醇后，由于其結構與膽固醇十分相似，會在腸道內與膽固醇競爭乳糜微粒表面的吸附位點從而降低膽固醇的吸收[3]；當二者共存于腸腔內時，可共同結晶沉淀，形成不溶物排出體外，進而達到降低膽固醇的作用[4-5]；同時，植物甾醇還能通過影響相關酶的活性，抑制膽固醇在肝臟內的生物合成及代謝[6]。

植物甾醇具有降低膽固醇的作用，能夠降低人群高膽固醇血癥的發生概率，但存在高熔點、低溶解度和低生物利用度等一系列問題，進而嚴重影響其食品品質、應用價值和范圍[7]。在食品工業中，主要是對植物甾醇進行物理、化學改性處理，以此來改善其溶解性或分散性，更好地利用其生理功效。物理改性形成的體系主要有納米粒、微/納米乳液、微/納米膠囊、脂質體等。周士嬌等[8]采用超聲輔助反溶劑沉淀法制備出粒徑為252.77～215.90 nm、包封率為95.39%～81.55%的乳清分離蛋白-植物甾醇納米顆粒，所得納米顆粒具有良好的穩定性，有利于小腸對植物甾醇的吸收，發揮其抑制膽固醇吸收的作用。駱兆嬌等[9]采用高壓微射流技術制備出豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒（OP-PS），所得OP-PS納米顆粒粒徑為139.28 nm，包埋率達98.63%，且具有較好的穩定性和水分散性。在前期研究中，本課題組運用現代納米技術制備出一種粒徑小[（93.35±1.222）nm]、分布均勻、穩定性良好的植物甾醇納米粒[10]。

目前，關于植物甾醇降低膽固醇效果的研究較多，但植物甾醇納米粒的制備改變了植物甾醇的溶解性、穩定性及吸收效率等，其降膽固醇效果需進行進一步探究。細胞水平試驗可在一定程度上消除器官試驗中細胞間的復雜作用，或體內試驗中神經體液調節的干擾，考察藥物直接作用于細胞的結果[11-12]。人肝癌細胞HepG2細胞雖為一種癌細胞，但其生物學特征與正常肝細胞相近[13]，并含有與人正常肝細胞具有同源性的生物轉化代謝酶，其具有較高的分化程度，保留性較完整且具有穩定的活性，便于進行傳代培養，是國際公認的研究降脂作用的細胞系[14-15]，廣泛用于模擬人體正常肝臟細胞，且常用于毒理學和肝臟保護等研究[16-17]。為更好地了解前期所制備的植物甾醇納米粒的降膽固醇效果，本研究以人肝癌細胞株HepG2細胞為輔助研究對象，觀察不同劑量植物甾醇納米粒對高膽固醇誘導的HepG2模型細胞內膽固醇含量的影響，從體外試驗研究明確植物甾醇納米粒的降膽固醇效果，為植物甾醇納米粒的應用提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物甾醇（≥95%），武漢遠成共創科技有限公司；大豆卵磷脂（≥70%），阿拉丁試劑有限公司；大豆分離蛋白（≥95%），新西蘭恒天然有限公司；HepG2細胞，上海中科院細胞庫；辛伐他汀（細胞級），MedChemExpress（MCE）公司；膽固醇，美國Sigma公司；96孔培養板、凍存管，Corning公司；70 mm細胞培養皿，JETBIOFIL公司。

DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液，Gibco公司；0.25%胰蛋白酶溶液，杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；雙抗（PS，青霉素、鏈霉素），Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma公司；MTS，普洛麥格（北京）生物技術有限公司；組織總膽固醇酶法測定試劑盒（E1015），北京普利萊基因技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、RIPA裂解液（強）、PMSF（100 mmol·L-1），碧云天生物技術研究所；總膽汁酸（Total Bile Acid，TBA）測試盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

INC108 CO2培 養 箱，德 國Memment公 司；TDZ5-WS 離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；XD-30倒置顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；iMark酶標儀，美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同濃度植物甾醇納米粒（PNP）的制備

按照前期研究[10]所得植物甾醇納米粒的最佳制備工藝條件制備植物甾醇納米粒，主要制備工藝如下。制備濃度為0.75%（w/w）大豆分離蛋白（SPI）分散液，4 ℃水化過夜；將植物甾醇與卵磷脂按1∶4（w/w）比例溶解在16 mL無水乙醇中，形成有機相；對SPI分散液進行高速分散（轉速為10 000 r·min-1），并將有機相緩慢注入其中，之后繼續分散5 min；所得混合溶液通過高壓均質（均質壓力為900 bar，均質次數為6次）形成穩定的植物甾醇納米分散液，旋轉蒸發除去乙醇，加水稀釋，得到試驗所需不同濃度的植物甾醇納米粒（PNP）。

1.3.2 HepG2細胞培養

HepG2細胞于完全培養液（含10%FBS+1%PS+89%高糖DMEM培養基）中恒溫靜置培養，每隔2～3 d更換一次培養液。培養期間應注意用顯微鏡觀察細胞有無被污染及細胞的生長情況，待細胞生長密度達到70%～80%時，即可進行細胞傳代。進行2～3次傳代至細胞生長情況穩定后進行下一步細胞試驗。HepG2細胞培養的具體操作參考文獻[18]中的方法。

1.3.3 植物甾醇納米粒和辛伐他汀對HepG2細胞活力的影響測定

為確定后續試驗中植物甾醇納米粒和辛伐他汀的作用濃度，本試驗采用MTS方法測定植物甾醇納米粒和辛伐他汀對HepG2細胞活力的影響。

試驗分為空白組、空白對照組、植物甾醇納米粒組（PNP，6個濃度）和陽性藥物辛伐他汀組（Sim，5個濃度），每組設6個復孔。PNP的干預終濃度分別是50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1和800 μg·mL-1；Sim干預終濃度為10 μmoL·mL-1、20 μmoL·mL-1、30 μmoL·mL-1、40 μmoL·mL-1和50 μmoL·mL-1；空白組為培養基；空白對照組為細胞+培養基。

按照MTS試劑盒說明書的要求檢測在植物甾醇納米粒和辛伐他汀中分別培養6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后HepG2細胞活力。按下列公式計算細胞活力，由此得出植物甾醇納米粒及辛伐他汀作用濃度及作用時間范圍。

1.3.4 高膽固醇HepG2細胞模型的建立

按照1.3.2的方法對細胞進行常規培養，將對數生長期的細胞消化、懸浮，細胞懸液均勻鋪在6孔板中。試驗分組如下。①正常組。常規培養的細胞。②模型組。含0.20 mmol·L-1膽固醇的培養基培養的細胞。③陽性藥物Sim組。含0.20 mmol·L-1膽固醇、20 μmoL·mL-1Sim的培養基培養的細胞。④PNP組。含0.20 mmol·L-1膽固醇、不同濃度的PNP（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1）的培養基培養的細胞；每個處理6個重復。作用24 h后，收集每孔中的培養基和細胞，按照相應試劑盒的要求處理。

1.3.5 培養基和細胞內總膽固醇含量的測定

試驗結束后，收集培養基和細胞，按試劑盒說明書要求加入適量的細胞裂解液進行細胞裂解，并于室溫2 000×g離心細胞和培養基，于550 nm波長下測定各孔OD值，根據標準曲線分別計算培養基和細胞內總膽固醇的濃度。

1.3.6 培養基和細胞內總蛋白含量測定

按照蛋白濃度測定試劑盒（BCA法）說明書要求，分別將1.3.5中余下的細胞裂解液和培養基于室溫以（10 000～14 000）×g離心3～5 min，取上清液用于測定。于562 nm波長下測定各孔OD值，根據標準曲線和使用樣品的體積分別計算出培養基和細胞內總蛋白含量。

1.3.7 培養基中總膽汁酸（TBA）含量的測定

將收集到的細胞培養基進行離心，按照試劑盒說明加入標準品或待測樣本、試劑一和試劑二，混勻，37 ℃孵育1.5 min后，于405 nm波長下測定各孔OD值，計算培養基中TBA的含量為

1.3.8 細胞內抗氧化指標測定

嚴格按照超氧化歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒說明測定上述細胞裂解液中這兩種抗氧化指標的活力，并用樣本中所含的蛋白濃度來進行校正，相關計算公式為

1.4 數據處理

實驗數據以平均數±標準誤差（x—±SEM）表示，兩組間比較用SPSS 17.0統計分析軟件進行t檢測，多組間比較采用one-way ANOVA檢測，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 植物甾醇納米粒對HepG2細胞活力的影響

HepG2細胞經過不同濃度的植物甾醇納米粒分別干預6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后，其細胞活力大小如圖1所示。與空白對照組相比，不同濃度植物甾醇納米粒分別作用HepG2細胞不同時間后，對HepG2細胞活力均有極顯著的影響（P＜0.001）。在6 h和12 h內，經所有濃度的植物甾醇納米粒作用后的HepG2細胞活力仍均在90%以上；在24 h和48 h內，800 μg·mL-1植物甾醇納米粒作用下的HepG2細胞活力分別為88.8%和87.3%，其他濃度植物甾醇納米粒處理下的HepG2細胞活力均在90%以上；在72 h內，600 μg·mL-1和800 μg·mL-1植物甾醇納米粒干預下的HepG2細胞活力分別為89.1%和87.2%，其他濃度植物甾醇納米粒干預的HepG2細胞活力均在90%以上。同一濃度的植物甾醇納米粒培養細胞不同時間后，隨著培養時間的延長，HepG2細胞活力越來越低（P＜0.001）；相同時間內，隨著植物甾醇納米粒濃度的增大，HepG2細胞活力極顯著降低（P＜0.001），說明植物甾醇納米粒對HepG2細胞活力的影響呈現劑量和時間效應。當細胞活力低于80%時即認為該藥物具有細胞毒性[19]。從試驗結果來看，在試驗濃度和作用時間范圍內，植物甾醇納米粒不具有細胞毒性，所以可以根據試驗需要選擇所需濃度和時間，但由于植物甾醇納米粒為淡黃色，考慮到顏色對吸光度的影響，故選擇濃度分別為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的植物甾醇納米粒進行后續試驗。

圖1 植物甾醇納米粒對HepG2細胞活力的影響

2.2 辛伐他汀對HepG2細胞活力的影響

因試驗需選用辛伐他?。⊿im）作為陽性對照，故考察了不同濃度的辛伐他汀對HepG2細胞活力的影響，結果如圖2所示。不同濃度的辛伐他汀干預HepG2細胞不同時間后，細胞活力較空白對照組均極顯著降低（P＜0.001）。相同時間內，HepG2細胞活力隨著辛伐他汀濃度的增大而極顯著降低（P＜0.001），相同濃度的辛伐他汀干預細胞不同時間后，HepG2細胞活力隨著干預時間的延長而極顯著降低（P＜0.001），說明辛伐他汀對HepG2細胞活力的影響呈現明顯的劑量和時間效應。在6 h、12 h和24 h內，50 μmoL·mL-1Sim干預下的HepG2細胞活力分別為85.0%、81.1%和80.2%，其他濃度Sim干預下的HepG2細胞活力大于90%；在48 h內，40 μmoL·mL 和50 μmoL·mL-1Sim作用下的HepG2細胞活力分別為89.4%和77.8%，其余濃度的Sim處理下的HepG2細胞活力均在90%以上；在72 h內，5個濃度Sim干預下的HepG2細胞活力分別為93.2%、89.9%、89.0%、87.0%和75.9%。從試驗數據可看出，50 μmoL·mL-1Sim在作用HepG2細胞超過24 h后呈現出細胞毒性，其他濃度的Sim在相應的作用時間內不具有細胞毒性。綜合試驗結果考慮，選用20 μmoL·mL-1Sim進行后續研究。

圖2 辛伐他汀對HepG2細胞活力的影響

2.3 植物甾醇納米粒對HepG2培養基和細胞內總膽固醇含量的影響

不同濃度的植物甾醇納米粒對培養基和細胞內總膽固醇含量的影響如圖3所示。模型組細胞內總膽固醇含量極顯著高于正常組（P＜0.01），經不同濃度的植物甾醇納米粒處理后，各處理組細胞內總膽固醇含量均極顯著低于模型組（P＜0.01）。其中 濃 度 為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1植物甾醇納米粒組的細胞內總膽固醇含量較模型組分別降低了16.97%、23.80%、30.36%和39.71%（P＜0.01），但均極顯著高于正常組（P＜0.01），不同濃度植物甾醇納米粒組組間差異極顯著（P＜0.01）。說明植物甾醇納米粒能有效降低高膽固醇細胞內總膽固醇含量，同時具有極顯著的劑量效應，但在試驗濃度范圍內，其效果極顯著低于陽性藥物辛伐他?。≒＜0.01）。對于培養基中膽固醇濃度，各組組間差異均極其顯著（P＜0.01），且培養基中的總膽固醇含量隨植物甾醇納米粒濃度的增大而極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，濃度為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1植物甾醇納米粒組的培養基中總膽固醇含量分別升高了53.56%、73.64%、104.43%和125.69%（P＜0.01）。

圖3 不同濃度的植物甾醇納米粒對培養基和細胞內總膽固醇含量的影響

2.4 植物甾醇納米粒對培養基中總膽汁酸含量的影響

不同濃度的植物甾醇納米粒對培養基中總膽汁酸含量的預防效果如圖4所示。模型組和各給藥組培養基中總膽汁酸含量均低于正常組，但不存在顯著差異（P＞0.05），且各組組間差異均不顯著（P＞0.05），說明植物甾醇納米粒對培養基中總膽汁酸含量沒有顯著的預防效果。

圖4 不同濃度的植物甾醇納米粒對培養基中總膽汁酸含量的影響

2.5 植物甾醇納米粒對HepG2細胞內抗氧化指標的影響

不同濃度的植物甾醇納米粒對細胞內SOD和CAT活力的影響如圖5和6所示。模型組細胞內SOD和CAT活力分別降低了66.84%和58.67%，均極顯著地低于正常組（P＜0.01）；經過不同濃度的植物甾醇納米粒干預24 h后，細胞內SOD和CAT活力較模型組均極顯著提高（P＜0.01），且隨著植物甾醇納米粒濃度的增大，其活力提高越明顯；與模型組相比，4個濃度的植物甾醇納米粒（50 μg·mL-1，100 μg·mL-1，200 μg·mL-1和400 μg·mL-1）干預下細胞SOD活力分別升高了25.11%、50.06%、87.53%和112.89%，分 別 比 正 常 組 低58.52%、50.24%、37.82%和29.41%；細胞CAT活力分別升高了20.66%、35.80%、62.87%和75.71%，分別較正常組低50.14%、43.88%、32.69%和27.39%，且各組之間均存在極顯著的差異（P＜0.01）。說明植物甾醇納米粒能夠有效提高高膽固醇細胞內SOD和CAT的活力，且具有極顯著的劑量效應，但效果低于比陽性藥物辛伐他汀，在試驗濃度范圍內不能使SOD和CAT活力恢復至正常水平。

圖5 不同濃度的植物甾醇納米粒對細胞內SOD活力的影響

圖6 不同濃度的植物甾醇納米粒對細胞內CAT活力的影響

3 結論

本研究以人肝癌細胞株HepG2細胞為輔助研究對象，并用膽固醇誘導，構建高膽固醇細胞模型，再用不同濃度的植物甾醇納米粒進行干預，觀察不同劑量植物甾醇納米粒對高膽固醇誘導的HepG2模型細胞的降膽固醇效果。植物甾醇納米粒不具有細胞毒性，能顯著降低細胞內膽固醇水平，且存在極顯著（P＜0.01）的劑量效應；能夠顯著提高細胞內抗氧化指標SOD和CAT的活力，劑量效應顯著（P＜0.01）。本研究為植物甾醇納米粒的降膽固醇效果提供理論依據，為植物甾醇納米粒作為膳食補充劑的應用提供了技術支持。