高溫大曲感官指標與理化指標、微生物群落和揮發性物質的關聯

鄧燦，高瑞杰，趙永威，繆禮鴻*，汪棉坤，劉蒲臨，陳家暉，范培文

1(武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢，430023)2(湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋，434200)

白酒釀造的過程實質上是釀酒微生物的生長和代謝過程[1]，其微生物來源豐富，酒曲、酒醅、窖泥等所攜帶的微生物均可能參與獨特風味基酒的生產。而白酒發酵過程中微生物主要來源于酒曲[2]，素有“曲為酒之骨”的美譽[3]。大曲是一種富含微生物菌群、菌系及復合曲香的微生態制品，具有糖化、發酵、生香等功能，是中國曲酒的主要糖化發酵劑和生香劑[4-6]，其質量直接影響著酒質的好壞[7-8]。

長期以來，釀酒行業中判定大曲質量多以感官指標評分為主[9]，或趨向于某些特定的理化及微生物指標[10]。邢鋼等[11]對目前大曲中微生物的種類做了系統的總結，并對不同溫度大曲制曲過程中的理化指標進行分析研究；宋瑞濱等[12]對濃香型大曲貯存期間理化指標的變化進行了研究；沈才洪等[13]以評分的方式設定了大曲質量標準體系。而目前從大曲品質差異分析出發，全面分析大曲感官指標與理化指標的相關性，以及不同品級大曲揮發性物質的對比研究較少。本研究通過對高溫優級大曲和高溫普級大曲的理化指標檢測、高通量測序及揮發性物質進行分析，探究不同品級高溫大曲的差異性，以期為大曲感官評價提供可靠的數據支撐，為提升大曲質量奠定基礎，為濃醬兼香型白酒高溫大曲質量標準體系的建立及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

發酵45 d高溫大曲，由湖北某著名白酒生產企業提供。

1.1.2 儀器與設備

7890B—5977B氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司；DB-WAX UI毛細管氣相色譜柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭(50/30 μm)，美國Supelco公司；STARTER2100精密酸度計，上海毅暢實業有限公司；DNP-9082恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；UV-5900PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑

土壤DNA提取試劑盒(DNeasy PowerSoil Kit)，德國QIAGEN公司；2×TaqPCR Master Mix，寶日醫生物公司；異戊醇(分析純)，天津凱通有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、氯仿、NaCl、無水乙酸鈉，均為分析純，國藥集團有限公司。

1.1.4 主要培養基

細菌培養基：牛肉膏蛋白胨培養基；霉菌培養基：PDA培養基；酵母培養基：孟加拉紅培養基；乳酸菌培養基：MRS培養基。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法及樣品前處理

每天跟隨大曲品質檢驗員選取10間曲房，每間曲房隨機選取10塊大曲，共計100塊。分別挑選出感官評分最高和最低的3塊大曲，將當天所取樣品粉碎后過20目篩，四分法取樣2 kg用無菌袋編號保存，分別置于-80 ℃冰箱和室溫備用。共取樣3 d，得到高溫優級大曲混合樣3例(編號YH1、YH2、YH3)，高溫普級大曲混合樣3例(編號LH1、LH2、LH3)。將-80 ℃冰箱內3 d所取優級曲樣品混勻后得到1例綜合樣編號YH，3 d所取普級曲樣品混勻后得到另1例綜合樣編號LH，用于高通量測序分析。

1.2.2 大曲感官評價方法

樣品由5名專業人員共同評價，參照大曲感官檢驗標準打分，詳見表1。平均分>90分的為優級曲，70～90分為中級曲，<70分的為普級曲。

表1 大曲感官檢驗標準表Table 1 Sensory scoring standard of Daqu

1.2.3 大曲理化指標檢測方法

水分、酸度、液化力、糖化力、發酵力等理化指標參照文獻[14]和QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》進行測定。

1.2.4 大曲微生物含量檢測方法

微生物計數參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》和《現代白酒釀造微生物學》[15]。取10 g樣品置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，加入數顆玻璃珠，室溫振蕩30 min，取菌液1 mL與9 mL無菌水梯度稀釋，取1×10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋菌液各1 mL進行涂布。細菌37 ℃恒溫靜置培養48 h，霉菌和酵母菌28 ℃恒溫靜置培養72 h后計數。

1.2.5 大曲的高通量測序

樣品用液氮研磨后置于2 mL離心管中，加入600 μL CTAB提取緩沖液，65 ℃水浴1 h，每隔15 min顛倒混勻數次，再加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液[V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1]，混勻后12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至新的無菌離心管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液和2倍體積的無水乙醇，混勻后-20 ℃沉淀45 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清液保留沉淀，用DNeasy PowerSoil Kit 試劑盒對DNA進行純化，步驟參考說明書，并用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的完整性[16-17]。

細菌16S rDNA全長擴增引物為515F和806R，真菌ITS區擴增引物為ITS1和ITS2。PCR擴增反應體系(50 μL)：1 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，22 μL雙蒸水。反應條件：94 ℃預變性 3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，72 ℃延伸10 min。擴增序列由上海美吉生物有限公司進行測序。

1.2.6 大曲揮發性物質的檢測方法

揮發性物質采用頂空固相微萃取-氣質聯用(headspace solid-phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)檢測。將5 g曲粉樣品置于20 mL 8.5 g/L NaCl和10 g/L CaCl2的水溶液中，振蕩混勻后冰浴超聲波處理30 min，然后將混合液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液。在20 mL頂空進樣瓶中，加入8 mL上清液，預先加入3 g NaCl使其飽和，最后加入10 μL內標(丙酸辛酯，終質量濃度為60.44 μg/L；L-薄荷醇，終質量濃度為125.41 μg/L), 使用雙內標法定量保留時間在丙酸辛酯之前的物質以丙酸辛酯為內標，保留時間在丙酸辛酯之后的物質以L-薄荷醇為內標。HS-SPME條件：三相萃取頭(DVB/CAR/PDMS，50/30 μm)，50 ℃預熱5 min，吸附萃取45 min，GC解吸20 min[18-19]。

氣相色譜條件：樣品通過DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W)色譜柱進行分離，進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速2 mL/min，不分流；升溫程序：50 ℃保持2 min， 以4 ℃/min的速率升至230 ℃, 保持15 min。質譜條件：電子轟擊電離，離子源230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，全掃描模式，掃描范圍35～350m/z。

1.2.7 數據處理

微生物計數和理化指標均用3次測定結果的平均值±標準差表示，采用SPSS 20軟件單因素方差分析，Origin 9.0作圖。

待測物峰面積采用SIM模式進行積分，積分結果帶入標準曲線計算，得到化合物最終濃度。

2 結果與分析

2.1 不同品級大曲理化指標差異分析

根據大曲感官檢驗標準對收集到的大曲進行評分(表2)，優級曲樣品YH1、YH2、YH3的評分均大于90，而普級曲樣品LH1、LH2、LH3的評分小于70，說明獲得的大曲樣品具有代表性，可進行后續研究。

表2 不同品級大曲感官評分Table 2 Sensory score of Daqu with different grades

大曲各項理化指標如圖1所示。大曲的水分含量與發酵溫度和高溫發酵時間直接相關，酸度則主要由產酸菌的有機酸代謝產生[20]。由圖1-a和1-b可知，3例優級曲樣品的水分含量均低于普級曲，酸度和氨態氮含量均高于普級曲。可能由于在發酵過程中普級曲曲塊內部發酵溫度不足，高溫發酵時間過短導致曲胚成熟時水分含量偏高；正因為普級曲發酵不夠徹底且產酸菌數量低于優級曲，所以其酸度偏低。

大曲發酵力代表著將發酵基質中可利用的糖轉化為酒精的能力，酯化力則是自身經發酵后固有的催化生酯能力，而酯類化合物正是白酒的主體香味成分。由圖1-c可知，優級曲的發酵力和酯化力均強于普級曲，說明優級曲能一定程度提高原酒的品質和出酒率；普級曲的液化力和糖化力相較于優級曲更強。大曲液化力和糖化力的強弱與微生物數量有直接的相關性[21]，分析原因為普級曲中產淀粉酶和糖化酶的微生物數量高于優級曲。

a-水分含量、酸度；b-糖化力、氨基酸態氮；c-發酵力、酯化力、液化力圖1 大曲理化指標柱形圖Fig.1 Physiochemical index of Daqu

2.2 不同品級大曲可培養微生物差異分析

不同品級高溫大曲中可培養微生物的數量存在顯著性差異且與理化指標有一定的相關性。如表3所示，普級曲樣品LH1、LH2、LH3可培養細菌和霉菌數均高于優級曲樣品YH1、YH2、YH3且差異顯著。

表3 大曲可培養微生物數量 單位：CFU/g

普級曲細菌總數最高達3.7×106CFU/g是優級曲的2倍以上，霉菌總數最高達6.7×104CFU/g是優級曲的3倍以上。大曲發酵過程中，高溫和偏酸性的環境會抑制不耐熱及不耐酸的微生物生長繁殖，使曲塊的微生物環境更加穩定，故優級曲發酵完成后可培養微生物數量較少。

大曲中可培養乳酸菌數量在不同的樣品間均存在著顯著差異，3例優級曲樣品中只有YH1在10-4稀釋梯度內檢出乳酸菌，分析原因為大曲在發酵過程中多種理化因素的共同作用下導致乳酸菌數量呈不規律變化。酵母菌的數量和大曲發酵力呈正相關，在優級曲樣品中均能檢出少量酵母菌，而普級曲樣品在10-2稀釋梯度內均未檢出酵母菌，該結果進一步印證了優級曲的產酒精能力更強。

2.3 不同品級大曲微生物群落組成差異分析

2.3.1 α多樣性分析

采用高通量測序技術，通過細菌16S rDNA全長區和真菌 ITS區測序分析了優級曲和普級曲的微生物組成。由表4可知，樣品的序列覆蓋度均>0.999，再次證明本次測序的結果能夠真實地反映所有樣本微生物的菌群結構。樣品YH細菌的操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)總數(58)是樣品LH(22)的2.6倍，Chao指數和Shannon指數均高于LH，即優級曲中細菌的種類更加豐富，細菌群落的多樣性更高；2個樣品的真菌群落則沒有顯著性差異。

表4 α多樣性指數Table 4 α diversity index

2.3.2 大曲細菌群落組成差異分析

由圖2可知，優級曲樣品YH中的芽孢桿菌屬(Bacillus)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)是主要細菌屬，普級曲樣品LH中枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)是主要細菌屬，且枝芽孢桿菌屬細菌占比高達73.87%。優級曲中乳桿菌屬細菌(Lactobacillus)占比1.46%，而普級曲中僅為0.1%，這說明優級曲中乳酸菌的數量實際是高于普級曲的，優級曲的酸度更高可能是乳酸菌產酸造成。

圖2 屬水平大曲細菌群落柱狀圖Fig.2 Histogram of bacterial community at genus level in Daqu

2.3.3 大曲真菌組成群落差異分析

由圖3可知，YH和LH樣品均由嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)和曲霉屬(Aspergillus)3個屬的真菌組成，即優級曲真菌微生物的組成種類與普級曲相同，但組成兩者真菌微生物的比例有明顯差異。優級曲中嗜熱真菌總占比高達98.89%，分別為Thermoascusaurantiacus(63.33%)、Thermomyceslanuginosus(33.44%)、Thermoascuscrustaceus(2.12%)，而普級曲中曲霉屬(Aspergillus)微生物占比達18.24%，優級曲僅為0.57%。嗜熱真菌是最高生長溫度為50 ℃及以上的特殊真菌類群，而曲霉屬真菌多不耐高溫，上述結果進一步證明了優級曲發酵時的溫度更高，高溫發酵時間長，高溫抑制了其他不耐熱的微生物，給嗜熱真菌的生長繁殖提供了良好的環境。

2.4 不同品級大曲揮發性物質含量差異分析

大曲風味物質是白酒香氣的重要來源，通過對樣本揮發性物質的測定和分析，共檢測到23種揮發性組分，其中酸類7種，酯類3種，醇類7種，醛類4種，吡嗪類1種，酚類1種。優級高溫大曲YH1揮發性物質的總離子流圖如圖4所示，說明GC條件可以將大曲揮發性物質很好地分離。

由表5可知，3例優級曲樣品中酯類、酸類、吡嗪類和酚類物質總量均高于普級曲，醇類化合物總量相近，醛類化合物則是普級曲較高。樣品YH2中酸類(11 918.65 μg/kg)和吡嗪類(3 975.09 μg/kg)物質含量最高；YH1中酯類物質含量最高(5 894.04 μg/kg)；LH3中醛類物質含量最高(1 719.69 μg/kg)。

a-優級曲樣品YH；b-普級曲樣品LH圖3 種水平大曲真菌群落餅狀圖Fig.3 Pie chart of fungal community at species level in Daqu

優級曲與普級曲樣品相比較，酯類物質中己酸乙酯差值最大(1 970.59 μg/kg)，己酸乙酯通常由己酸和乙醇經微生物酯化而成，優級曲中酵母菌數量高且酯化力強，所以其酯類化合物更為豐富；酸類物質中異戊酸差值最大(2 689.51 μg/kg)，大曲中酸類物質與乙酸菌、乳酸菌等微生物的代謝作用有關，優級曲中細菌種類豐富，乳酸菌含量高正是其酸類化合物含量高的原因；優級曲中四甲基吡嗪含量較高，樣品YH2和LH3的差值最大(1 970.59 μg/kg)，吡嗪類化合物是大曲生產過程中發生美拉德反應所形成的[22]，由于優級曲的發酵溫度更高，高溫有利于美拉德反應的進行，促使大量含氮類化合物生成，所以吡嗪類化合物含量遠高于普級曲。

圖4 優級高溫大曲YH1揮發性物質離子流圖Fig.4 Total ion current map of volatile compounds from superior high-temperature Daqu YH1

表5 不同品級大曲揮發性物質的含量Table 5 Content of volatile compounds in different grades

續表5

由圖5不同大曲樣品揮發性物質含量分布熱圖可看出，優級曲和普級曲揮發性物質含量差異顯著，優級曲暖色區主要集中在A、B、E、F組化合物，而普級曲暖色區主要集中在C、D組化合物。結合表5可知，優級曲樣品中異戊酸、己酸乙酯、糠醛、四甲基吡嗪的含量明顯高于普級曲，異丁醛和異戊醛含量則明顯較低。

圖5 大曲揮發性物質熱圖Fig.5 Heat map of volatile compounds in Daqu

主成分分析顯示了大曲樣品中揮發性物質組成的相似性和差異性。基于大曲發酵后揮發性物質的構成，通過主成分分析模型從整體上反映不同品級高溫大曲樣品間的差異，所提取主成分累計貢獻率達77.3%，說明信息提取較完整。如圖6所示，6例大曲樣品形成獨立的4簇，樣品YH1和YH2距離較近，形成1簇；樣品LH1和LH3形成1簇；樣品YH3和LH2分別形成1簇。結果表明，優級曲樣品YH1、YH2、YH3與普級曲樣品LH1、LH2、LH3的揮發性物質組成在PC1方向有顯著性差異。將大曲揮發性物質分成2組，優級曲樣品的揮發性物質組成與Group Ⅰ(異戊酸、異丁酸、己酸乙酯、丙酸乙酯、四甲基吡嗪、糠醛等)有較高的相關性，而普級曲樣品與Group Ⅱ(正丁醇、正己醇、異丁醛、異戊醛、苯甲醛等)相關性較高。

圖6 大曲揮發性物質組成主成分分析Fig.6 Principal components analysis of volatile compounds in Daqu

3 結論與討論

大曲的傳統感官評價是釀造大曲酒不可或缺的工藝流程之一，本文以感官評分作為衡量大曲質量的基礎，通過對不同感官得分樣品生化指標，微生物群落結構和揮發性物質含量的分析，來比較不同品級高溫大曲的差異。結果表明，優級曲的酸度、氨態氮含量、發酵力和酯化力更高，水分含量、液化力和糖化力則低于普級曲；在微生物群落結構上，普級曲中可培養微生物數量更多，細菌和霉菌數均高于優級曲，但優級曲中酵母菌數量較多且細菌群落的多樣性更為豐富；兩者真菌組成種類相同，普級曲中曲霉屬(Aspergillus)微生物占比達18.24%，優級曲中僅為0.57%且嗜熱真菌高達98.89%，說明優級曲發酵時的溫度更高；在揮發性物質上，優級曲樣品中酯類、酸類、吡嗪類和酚類物質含量均高于普級曲，其中異戊酸、己酸乙酯、糠醛和四甲基吡嗪這4種化合物的差異最為顯著。

白酒中揮發性物質主要來源于多種微生物代謝產物的相互轉化，酯類化合物是白酒風味的主要組成部分，酸類物質是生成酯類化合物的前驅物質，可以增長后味，消除白酒中的苦味并增加醇和感，而四甲基吡嗪也與醬香型白酒的品質密切相關。由此可見無論是從生化指標還是特征揮發性物質含量上，優級曲均更滿足大曲酒釀造的工藝需求。

大曲揮發性物質的變化與微環境差異和微生物分布密切相關，為了更深入地揭示高溫大曲揮發性物質與微生物之間的關系，需要結合現代分子生物學方法對大曲功能微生物進行分離鑒定與代謝分析，還有待后續研究。本研究結果為大曲的傳統感官評價提供了可靠的數據支撐，為高溫大曲質量標準體系的建立及應用提供了一定的理論參考。