植物源多酚對梨酒抗氧化能力及其感官品質的影響

刁體偉，陳曉姣，冷銀江，魏鑫，賴曉琴，馬懿*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644005)2(四川省釀酒專用糧工程技術研究中心，四川 宜賓，644000)

庫爾勒香梨是我國新疆最具代表性的優良梨種。研究表明，飲用庫爾勒香梨酒不僅能生津止渴、潤腸通便，還對高血壓、心臟病、失眠癥等患者有較好的輔助治療作用[1]。梨酒在釀造過程中易被氧化褐變，需要添加大量SO2來起到抗氧化的作用。而果酒中高殘量SO2會產生異雜味(H2S、硫醇)并具有致敏性(蕁麻疹、腹瀉、皮炎)，SO2的過量攝入和累積甚至會對重要器官造成毒性損傷[2]。因此，少硫或者無硫發酵是釀造業的重點和難點，而目前無硫果酒主要是依靠各種天然化合物的添加以及使用創新的釀酒技術來完成[3]。

白藜蘆醇和茶多酚均屬于植物源天然提取物，具有來源廣泛、安全性高、活性強等特點[4]。白藜蘆醇是一種具有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，由葡萄、桑樹和虎杖等植物次生代謝產生，屬于植物的保護素和抗毒素[5]；茶多酚是茶葉中酚類及其衍生物的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮類、花色苷類及黃酮醇類等化合物，是一種天然的抗氧化劑[6]。白藜蘆醇與茶多酚因具有良好的抑菌、抗氧化、免疫調節等生物特性而被廣泛應用于保健食品、食藥加工、果蔬保鮮等領域[5,7]。PASTOR等[8]將白藜蘆醇用于葡萄酒釀造，生產的葡萄酒具有較好的物理、化學和感官特性。謝天柱等[9]研究發現茶多酚能夠顯著提高蘋果酒的抗氧化能力。

相比于抗氧化劑SO2釀造果酒，白藜蘆醇與茶多酚的添加還能減少果酒中H2S、硫醇含量，賦予果酒更好的功能性。添加了0.1%茶多酚的酒及飲料具有顯著去除口臭效果[10]。LEFVRE-ARBOGAST等[11]指出在飲食中搭配紅酒和茶多酚能夠有效降低患阿爾茨海默病風險。未來果酒及飲料逐漸向著安全、功能型方向發展，因而植物源多酚作為綠色抗氧化劑具有一定發展潛力。然而,植物源多酚應用于梨酒中的抗氧化性能以及對梨酒風味感官的影響尚無相關研究報道。

基于此，本研究主要比較不同濃度的白藜蘆醇、茶多酚與SO2(70 mg/L)對庫爾勒香梨酒抗氧化能力及其風味感官品質的影響，旨在促進新型抗氧化劑在梨酒釀造中的應用，以期為低硫梨酒開發研究，推動果酒行業發展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

庫爾勒香梨、白砂糖，市售；果酒干酵母，安琪酵母股份有限公司；果膠酶，上海源葉生物科技有限公司；DPPH、ABTS標準品、福林酚、茶多酚(純度≥98.0%)，合肥博美生物科技有限責任公司；沒食子酸標準品(純度≥98.0%)、白藜蘆醇(純度≥98.0%)，成都市科龍化工實劑廠；福林-丹尼斯試液，廈門海標科技有限公司；仲辛醇(色譜純)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JYZ-E25榨汁機，九陽股份有限公司；GZ-250-HS11恒溫恒濕箱，廣智科技設備有限公司；STARTER 2C型pH計，奧豪斯儀器有限公司(上海)；LX-B75L高壓蒸汽滅菌鍋，成都宜恒實驗儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；UitraScan VIS臺式色差儀，HunterLab(美國)有限公司；7890A氣相色譜儀，四川蜀科儀器有限公司；i-Nose 電子鼻測定儀、SmarTongue，美國isenso公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 梨酒釀造工藝流程與操作要點

梨酒釀造工藝如圖1所示。

圖1 梨酒釀造工藝流程圖Fig.1 Flow chart of pear wine brewing process

香梨榨汁與成分調整：選擇新鮮成熟的香梨洗凈去核榨汁，添加0.3 g/L果膠酶，室溫酶解12 h。過濾采用8層紗布；分別加入一定量白砂糖與KHCO3，調節糖度到20Bx，pH調至4.5。

SO2、白藜蘆醇與茶多酚的添加：根據酵母對三者耐受性并考慮應用于梨酒發酵適用性(預實驗發現多酚添加量超過250 mg/L時，梨酒色度會加深，影響美觀)，將試驗共分為10個組(每組3個平行)：

空白(無添加)：CK組；

SO2：S組(70 mg/L)；

白藜蘆醇：R1組(100 mg/L)、R2組(150 mg/L)、R3組(200 mg/L)、R4組(250 mg/L)；

茶多酚：T1組(70 mg/L)、T2組(80 mg/L)、T3組(90 mg/L)、T4組(100 mg/L)。

發酵：稱取2 g果酒干酵母加入30 mL質量濃度為50 g/L蔗糖水中，置于30 ℃活化30 min，隨后加入10 mL香梨汁，室溫放置30 min，將4 mL酵母活化液分別添加到10組梨汁中用于發酵。發酵溫度控制為25 ℃，發酵完成后過濾陳釀20 d裝瓶。

1.3.2 基礎理化指標的測定

可溶性固形物采用手持糖度儀測定，pH測定使用pH計，酒精度、還原糖、總酸測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 體外抗氧化能力的測定

參照由璐等[12]的方法，以DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率代表抗氧化能力。

取0.5 mL待測樣品與3.5 mL DPPH溶液混合并充分搖勻，避光靜置30 min，然后在517 nm處測定吸光度(A樣品)。同時，以等量蒸餾水代替樣品作空白對照試驗(A空白)。DPPH自由基清除率按公式(1)計算。

(1)

吸取1 mL待測樣品與3 mL ABTS陽離子自由基工作液，混合10 s后立即置于暗處準確反應6 min，在734 nm下測定吸光度(A樣品)。同時，以等量蒸餾水代替樣品作空白對照試驗(A空白)。ABTS陽離子自由基清除率按公式(2)計算。

(2)

1.3.4 多酚相對聚合度的測定

參照張大為等[13]的方法測定多酚相對聚合度。

1.3.5 總酚含量的測定

總酚含量使用福林-肖卡法[14]測定，以沒食子酸質量濃度計。測定標準曲線結果為：y=0.019 42x+0.021 7，y為吸光度,x為沒食子酸含量，相關系數R2=0.997。

1.3.6 氨基酸含量的測定

參照伍清芳等[15]的方法使用異硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相色譜法對梨酒中17種氨基酸測定。

色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相A：稱取1.64 g無水乙酸鈉，加適量水溶解，加入0.5 mL三乙胺，用水定容至1 L，用20%(體積分數)乙酸溶液調pH至6.20，0.45 μm水系濾膜過濾。流動相B：V(乙腈)∶V(水)=8∶2。流量1.0 mL/min；進樣體積10 μL;柱溫40 ℃；檢測波長254 nm。

1.3.7 揮發性物質的測定

參照周文杰等[1]的頂空固相微萃取-氣質聯用法(solid phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry,SPME-GC-MS)并加以改進。在15 mL頂空瓶中準確加入8.0 mL梨酒，并加入1 g NaCl。酒樣在45 ℃條件下預熱10 min后，將老化后的微萃取頭插入頂空瓶中，同時推出纖維頭(距離梨酒液面1.5 cm)，于頂空位置吸附35 min，吸附后，收回纖維頭并迅速送至GC送樣口，在250 ℃熱解析3 min。GC條件：DB-WAX毛線管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；采用不分流進樣模式；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留5 min，以2 ℃/min升溫至60 ℃，以5 ℃/min升溫至180 ℃，保留5 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃，保留10 min；載氣為高純He，恒定流速1.2 mL/min。MS條件：電子轟擊電離源(EI)，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，采集模式為全掃描，MS四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min。

揮發性物質定性定量：色譜峰對應的質譜通過與NIST/Wiley Database進行檢索比對，保留匹配度大于80%的鑒定結果。通過內標物(仲辛醇)的峰面積和梨酒中各組分的峰面積比值，計算各個組分的質量濃度。

1.3.8 電子鼻檢測方法

參照張清安等[16]的方法略作修改，取20 mL樣品放置于50 mL離心管中并密封，用電子鼻對其頂空氣體進行測定。電子鼻采樣參數設置如表1所示。

表1 電子鼻傳感器及對應性能描述Table 1 Description of electronic nose sensor and its corresponding performance

1.3.9 電子舌檢測方法

參照張清安等[16]的方法。取每個樣品20 mL放置于電子舌儀器專用測量杯內進行分析測定。儀器選取6個探測器，采樣時間和傳感器自動清洗時間共計4 min，分別提取各傳感器的特征值進行分析。

1.3.10 數據分析

利用SPSS進行數據分析，并用Origin 2018作圖，所有數據均用平均值±標準差表示。顯著性分析使用Duncan檢驗法，結果采用標記字母法表示，以上所有實驗均設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 梨酒的基礎理化指標

由表2所示，發酵完成后10個組的酒精度、還原糖、pH、可溶性固形物、總酸含量各指標并無顯著性差異(P>0.05)。表明與SO2相比，白藜蘆醇和茶多酚對梨酒的基礎理化指標沒有顯著性影響，發酵能夠正常完成。此外，R1～R4組發酵周期(7 d)比其他組均少1 d，原因可能是白藜蘆醇的添加影響了酵母的生長代謝，從而加快了發酵進程。盡管發酵過程中酵母生長趨勢不同，但并不影響發酵完成梨酒的理化指標。

表2 不同組梨酒的基礎理化指標Table 2 Basic physical and chemical indexes of pear wine in different groups

2.2 梨酒的抗氧化活性

自由基清除率越高就代表物質的抗氧化能力越強，但由于反應機制和特性差異，故抗氧化能力測定通常使用2種及以上方法[17]。由圖2可知，添加不同濃度白藜蘆醇和茶多酚的梨酒對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率有所差異。R3組對自由基清除率高于S組(P<0.05)，R2、T3、T4組抗氧化能力與S組并無顯著性差異，但清除率都遠高于CK組(P<0.05)，表明白藜蘆醇(150～200 mg/L)、茶多酚(90～100 mg/L)同SO2一樣，具有增強梨酒抗氧化能力的作用。梨酒抗氧化能力隨著白藜蘆醇(100～200 mg/L)和茶多酚(70～100 mg/L)濃度的增加而增強(濃度范圍內)，原因可能是植物源多酚的添加使得酒體中酚類物質得以更多的保留，從而提升了梨酒抗氧化能力[18]。LPEZ-VéLEZ等[19]研究顯示，葡萄酒中的白藜蘆醇具有顯著的抗氧化性和清除自由基活性；李變變[20]提出，0.02%質量濃度的茶多酚能夠提高蘋果酒的抗氧化能力，這都與本試驗結果相似。此外，盡管白藜蘆醇和茶多酚都表現出抗氧化性，但并不是用量越多越好，抗氧化成分被氧化后所產生的過氧化自由基具有一定的氧化作用，會引起連鎖的消極副反應。

a-DPPH自由基清除率；b-ABTS陽離子自由基清除率圖2 不同組梨酒抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of pear wine in different groups

2.3 梨酒的總酚含量與多酚聚合度

總酚作為梨酒中不可缺少的功能性物質，對人體健康有著積極的影響。相比于CK組，SO2、白藜蘆醇和茶多酚的添加都能顯著增加酒體總酚含量(圖3-a)，其中R3組總酚含量最高(242.87 mg/L)，比S組含量高9.62 mg/L(P<0.05)。R1～R4組總酚含量均出現先上升后下降規律，可能與白藜蘆醇在梨酒中低溶解度和不穩定性有關[21]。相關性分析結果顯示，總酚含量與DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率有較為顯著的相關性，相關系數分別為0.838(P<0.01)和0.893(P<0.01)，表明梨酒中酚類物質是其抗氧化能力的重要物質基礎。如圖3-b所示，不僅S、R3、T3三組多酚聚合度有明顯降低，所有處理組的多酚聚合度較對照組均有顯著減少。聚合度的降低會削弱芬頓反應，從而達到抑制梨酒中多酚被氧化的作用，使得發酵過程中可以更多地保留營養物質。

a-總酚含量；b-多酚聚合度圖3 不同組梨酒總酚含量與多酚聚合度Fig.3 Total polyphenol content and the degree of polyphenol polymerization of pear wine in different groups

2.4 氨基酸含量的測定

氨基酸不僅是梨酒中重要的營養物質，還是呈味物質，其具有酸味、甜味、苦味、鮮味和澀味，與酒體中醇、醛、酮類等物質發生協同作用后能提高味覺的層次感[22]。將抗氧化活性和多酚含量表現優異的2組(R3、T3)同CK組與S組做氨基酸含量比較。結果如表3所示，梨酒中富含常見17種氨基酸，其中精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)為主體氨基酸。CK組氨基酸總含量為4 521.32 mg/L，以丙氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸含量為主體，感官上主要呈現臭味和甜味；S組氨基酸總含量最高，為4 767.68 mg/L(P<0.05)，以蘇氨酸、亮氨酸、賴氨酸為主體，主呈苦、甜味；R3組為4 275.26 mg/L，以精氨酸，異亮氨酸、賴氨酸為主體，主呈苦味；T3組為4 467.34 mg/L，以精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸為主體，主呈苦、甜味。由此可見，抗氧化劑的加入能增加酒體中苦、鮮型氨基酸的含量，同時減少臭型氨基酸的生成，總體或能提高梨酒味覺層次感。不同組中氨基酸含量的差異性可能是因為添加物會影響酵母的生長能力和代謝途徑，導致在發酵過程中酵母對氨基酸利用率的不同[23]。

2.5 梨酒中揮發性物質含量

2.5.1 揮發性物質構成及比較分析

綜合考慮白藜蘆醇與茶多酚抗氧化活性能力及感官指標，R3組與T3組具有較好的適用梨酒釀造潛力，故將R3、T3、S、CK組揮發性成分進行比較分析。由表4所示，4組揮發性物質共檢出38種，主要分為6類(酯類、醇類、烷類、醛類、酸類、酚類)，其中酯類和醇類是香梨酒中主要揮發性物質。在CK組中共檢出揮發性物質20種，總含量為12 278.54 μg/L；S組31種，總含量11 499.99 μg/L；R3組25種，總含量9 102.51 μg/L；T3組29種，總含量10 190.67 μg/L。R3組種類和含量都低于其他3組(P<0.05)，其差異性可能是添加物對雜菌的抑制效果不同或是間接影響了酵母的代謝。

表3 不同添加物梨酒中氨基酸含量 單位：mg/L

表4 不同添加物梨酒中香氣物質含量 單位：μg/L

續表4

4組梨酒總酯含量依次為CK組(651.41 μg/L)>T3組(475.48 μg/L)>S組(429.23 μg/L)>R3組(355.72 μg/L)，R3組的酯類含量最低，并與其他3組有顯著性差異。梨酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯能突顯酒體果香型氣味，表明CK組果香味相對突出。

醇類物質總含量依次為S組(13種)>T3組(12種)>R3組(10種)>CK(9種)。S組、T3組與CK組在總醇含量上并無顯著性差異(P>0.05)，R3組含量最低，為8 469.22 μg/L，比S組少1 966.68 μg/L。結果顯示，異丁醇、苯乙醇、異戊醇為梨酒中主要醇類物質，其中CK組與S組異戊醇含量顯著高于R3組與T3組(P<0.05)，異戊醇含量過高會導致酒體風味不協調，產生苦味且引發頭痛。此外，T3組中3-甲基-3-丁烯-1-醇、正辛醇含量相對于其他3組較高(P<0.05)，使得酒體具有更強的典型性。S組中3-甲硫基丙醇含量顯著高于其他3組，原因可能是SO2的脅迫促進了酵母對硫元素的同化，從而導致甲硫氨酸下游產物3-甲硫基丙醇含量的增加[24]。醇類含量和種類的差異性可能是由于不同添加物引起發酵過程中的醇類被酯化或還原。

烷類、醛類、酸類、酚類等其他香氣成分對梨酒的特征香氣成分起到修飾作用，增加酒體的復雜性。S組與T3組含量相比于CK組差異性較小，R3組含量最低，酒體香氣相對單一。此外，辛酸含量CK組(123.22 mg/L)>T3組(23.18 mg/L)>S組(14.90 mg/L)>R3組(5.38 mg/L)，辛酸是果酒酸類成分的主體，能夠帶給酒體果味、草莓味、糖果味。

2.5.2 揮發性物質主成分分析(principal component analysis，PCA)

對6類揮發性物質含量進行PCA，相關矩陣的特征值及貢獻率見表5。PC1的貢獻率為43.10%，PC2的貢獻率為32.01%，PC3的貢獻率為24.89%，三者累積貢獻率為100%。由于三維圖不易觀察樣品分布情況，故取前2個主成分做PCA因子載荷圖(圖4)。各指標之間相關性強的變量聚集在一起，距離越近，相關性越大。由圖4所示，4組梨酒發生明顯分離，PC1與PC2能夠明顯區分CK、S、R3與T3梨酒，表明不同添加物梨酒的揮發物相似度較低。

表5 主成分的特征值及貢獻率Table 5 Characteristic values and contribution rates of principal components

2.6 電子鼻與電子舌結果

2.6.1 電子鼻測定結果

通過提取各個傳感器的響應值建立不同添加物梨酒樣品的氣味雷達圖，結果見圖5。S1、S6、S8、S9、S14傳感器對不同添加物梨酒的氣味響應值差異不大。相比于CK組，S2(H2S、硫)和S12(硫化物)探頭對S組梨酒響應強度較大，對R3組反應強度最低，表明SO2的添加會增加酒體中硫化物的生成，而白藜蘆醇添加可能對硫化物生成有抑制作用；此外，S4(有機溶劑)對CK組響應較強、S5(食物烹飪揮發性氣體)對R3響應較大，S11(芳香族化合物)對T3組響應較大。

圖4 揮發性化合物PCA載荷圖Fig.4 PCA loading plot of volatile compounds

圖5 不同梨酒樣品的電子鼻測定響應值的雷達圖Fig.5 Radar diagram of response values determined by electronic nose of different pear wine samples

基于14個探頭信號數據建立電子鼻主成分二維圖，結果見圖6-a，PC1(94.3%)遠大于PC2(2.3%)，梨酒樣品方差總貢獻率為96.6%，全部傳感器的響應結果基本包含在內。判別因子分析(discriminant factor analysis，DFA)顯示DI=98.42(圖6-b)，表明樣品之間基本沒有重疊性，即不同抗氧化劑的加入時，梨酒樣品的嗅覺指標(電子鼻傳感器響應值)有顯著差異，對其揮發性風味品質的影響較大。

a-PCA；b-DFA圖6 不同抗氧化劑對梨酒的電子鼻PCA和DFA結果Fig.6 PCA and DFA results of different antioxidants on pear wine by electronic nose

2.6.2 電子舌測定結果

采用電子舌方法評價不同組梨酒樣品的PCA與DFA結果如圖7所示。在PC1的貢獻率為59.15%，PC2的貢獻率為11.32%，PCA主要成分累計貢獻量為70.47%。DFA顯示DI=99.92，說明樣品之間具有差異性，不同抗氧化劑的添加對梨酒的口感具有一定的影響。

a-PCA；b-DFA圖7 不同抗氧化劑對梨酒的電子舌PCA和DFA結果Fig.7 PCA and DFA results of different antioxidants on pear wine by electronic tongue

3 結論

本試驗以酒體基礎理化指標、總酚含量、抗氧化性及感官特性來比較白藜蘆醇、茶多酚和SO2作用梨酒品質的影響。結果表明，白藜蘆醇(100～250 mg/L)和茶多酚(70～100 mg/L)在梨酒釀造中均能起到抗氧化作用，能夠改善酒體顏色，使得梨酒擁有較好的感官層次特性。白藜蘆醇(200 mg/L)相比SO2(70 mg/L)的添加，能賦予梨酒更強的抗氧化性，其總酚含量(242.86 mg/L)顯著高于SO2組(233.25 mg/L)。各組主體氨基酸比較顯示，CK組中丙氨酸(582.17 mg/L)、甲硫氨酸(616.07 mg/L)相對含量較高；S組蘇氨酸(396.40 mg/L)、亮氨酸(257.86 mg/L)含量突出；R3組以精氨酸(477.21 mg/L)、異亮氨酸(115.34 mg/L)為主；T3組精氨酸(642.98 mg/L)、蘇氨酸(459.15 mg/L)含量較高。根據對各組揮發性物質的比較和PCA結果，白藜蘆醇、茶多酚與SO2的加入對酒體風味物質有一定影響，特別是酯類和醇類含量差異明顯。白藜蘆醇、茶多酚均能降低梨酒中異戊醇、3-甲硫基丙醇等不良氣體的含量；茶多酚能使乙酸乙酯和乙酸苯乙酯含量分別增加30.09、44.13 mg/L，保留了更好的果香味，能使酒體表現更強層次感。添加白藜蘆醇與茶多酚的梨酒揮發性物質總含量與種類低于SO2組，可能是因為兩者的不穩定性和低溶解度而限制其功能活性的表達?？傮w表明，白藜蘆醇(200 mg/L)和茶多酚(90 mg/L)同SO2(70 mg/L)一樣具有良好的抗氧化性，但對部分氨基酸、酯醇類風味物質含量有一定影響，與添加SO2的梨酒在感官上具有差異性。