高蛋白酶活力米曲霉BL18在豆瓣醬制曲和發酵中的應用

范林旭，付建華，鈕成拓，鄭飛云，王金晶，劉春鳳，許鑫，李崎*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

豆瓣醬是一種以蠶豆和面粉為主要原料，在霉菌、酵母菌和乳酸菌等微生物的協同作用下，自然發酵而成的半固體粘稠狀食品。其色澤紅潤、風味獨特、營養豐富，已成為日常生活及餐飲行業不可缺少的調味品[1]。豆瓣醬發酵主要分為制曲和醬醅發酵兩步，其中制曲主要依賴微生物分泌的豐富蛋白酶資源實現對蠶豆瓣中大分子物質的降解，為后期豆瓣醬發酵過程中微生物生長代謝與風味化合物形成提供了關鍵前體物質。因此，在制曲過程中提高成曲的蛋白酶活力是加快豆瓣醬發酵周期且改善豆瓣醬品質的關鍵。

米曲霉是一種絲狀真菌，其通常作為常用發酵劑應用于亞洲傳統豆類發酵食品的生產，被美國食品藥品監督管理局和世界衛生組織認定為公認安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的微生物[2]。在制曲過程中，米曲霉會分泌大量蛋白酶，將蠶豆中的蛋白質降解成寡肽和氨基酸。這些酶解產物不僅可以為發酵過程中微生物的生長代謝提供必須的營養源，也作為豆瓣醬中的增味劑，促進風味化合物的積累[3]。因此，具有高蛋白酶活力生產能力的米曲霉被認為是豆瓣醬生產的理想菌種。米曲霉3.042是國內豆瓣醬發酵行業中常用的菌株，在制曲過程中具有較強的蛋白酶生產能力[4]。近年來，研究人員通過菌株誘變篩選及菌種改造策略獲得了高產蛋白酶的米曲霉菌株，如紫外線誘變[5]、原生質體融合育種[6]和常溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)誘變。GAO等[7]通過ARTP獲得了米曲霉3.042突變體H8，其酸性、中性和堿性蛋白酶活力較出發菌提高7.56%、28.92%和26.23%。在前期研究過程中，本研究室從豆瓣醬醬醅中篩選得到1株具有較高蛋白酶產生能力的米曲霉BL18[8]。在此基礎上，以目前行業常用釀造菌株米曲霉3.042為對照，分析了制曲過程米曲霉孢子數、蛋白酶活力以及成曲游離氨基酸含量，測定了后續發酵過程蛋白酶活力、理化參數，從制曲、發酵2個階段探究了米曲霉BL18在實際生產中應用的可能，同時從基因組水平深入挖掘了米曲霉BL18表型產生差異的原因。

1 材料和試劑

1.1 材料

1.1.1 菌株及主要試劑

菌株：米曲霉(Aspergillusoryzae) BL18(保藏號CGMCC No.19628)篩選自豆瓣醬醬醅、米曲霉3.042為目前常用的豆瓣醬制曲微生物，保藏于本實驗室。

主要試劑：H2SO4、NaCl、36%(體積分數，下同)甲醛水溶液、Na2CO3、三氯乙酸、95%乙醇、干酪素等。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養基：稱取土豆200 g，煮沸30 min，過濾后定容至1 L，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 儀器和設備

超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HHS型數顯式電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司；全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA株式會社；恒溫恒濕培養箱，上海博迅實業有限公司；紫外可見分光光度計，UNICO(上海)儀器有限公司；1100液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；電子天平、pH計，METTLER TOLEDO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化及孢子液制備

米曲霉BL18與米曲霉3.042接種到PDA培養基活化后，接種至PDA固體平板，30 ℃培養3 d，用無菌生理鹽水將孢子沖下經紗布過濾后完成孢子懸液制備。

1.2.2 制曲

干蠶豆泡發，經高溫蒸煮并冷卻到40 ℃左右拌入面粉(15%，質量分數)，分別接種米曲霉BL18和3.042孢子液，接種量為1×106個/g。放置在30 ℃、相對濕度90%恒溫恒濕培養箱，每隔8 h通過肉眼觀察并通過照相機拍照，取樣測定蛋白酶活力及孢子數，48 h后每隔16 h觀察拍照及取樣測定。

1.2.3 發酵

將成曲與170 g/L的鹽水按質量比1∶1.1投入透明塑料小桶，攪拌均勻。置于30 ℃培養箱中靜置發酵。發酵第一周，每天進行翻醬。發酵一周后每隔7 d進行翻醬取樣。

1.2.4 理化指標測定

孢子數測定參照SB/T 10315—1999《孢子數測定法》；蛋白酶活力測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法 福林法》，條件為酸性(pH 3.0)、中性(pH 7.2)和堿性(pH 10.0)；氨基酸態氮測定參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定 酸度計法》；可滴定酸測定參照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定 pH計電位滴定法》。水分及pH測定參照文獻[9]的方法。

1.2.5 游離氨基酸含量測定

稱取樣品1.0 g研磨均勻，用50 g/L三氯乙酸溶解并轉移至25 mL容量瓶定容。常溫超聲20 min，靜置2 h。經雙層濾紙過濾后，取1 mL濾液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL經0.22 μm水膜過濾于液相瓶，使用Agillent 1100高效液相色譜儀進行測定分析，條件如下：色譜柱：ODS柱4.6 mm×250 mm×5 μm；流動相A：醋酸鈉溶液(20 mmol/L)；B：V(醋酸鈉溶液)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2；流速1.0 mL/min；檢測波長338 nm(脯氨酸262 nm)；洗脫方式等度洗脫；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

1.2.6 米曲霉BL18基因組測序分析

使用BGI定制的磁性植物基因組DNA試劑盒提取米曲霉BL18的基因組DNA。確認提取DNA濃度、純度以及完整性后，在華大基因(中國深圳)的PacBio Sequel系統上進行全基因組測序。首先，使用g-TUBE裝置將1 μg基因組DNA剪切成10～15 kb的片段。然后通過SMRTbell?Express Template Preparation Kit 2.0構建文庫，最終使用Sequel (PacBio) Sequencing Kit 2.0對SMRTbell文庫進行測序。

原始測序數據首先過濾包含測序接頭、低質量堿基比率和高未知堿基比率的讀數。對這些過濾后的高質量數據進行數據統計分析和下游生物信息學分析。結合多種軟件對測序數據進行組裝，經過Subreads糾正、Corrected Reads組裝、組裝結果糾正、構建Scaffold及補洞四步對基因組進行組裝。從頭注釋所采用的軟件包括Genewise[10]、SNAP[11]、Augustus[12]、Genemarkes[13]；同時利用多種數據庫進行功能注釋，包括分析NR、KEGG、COG、GO數據庫、EggNOG以及Swiss-Prot等數據庫(無特殊說明的軟件采用默認參數)。原始數據和基因組組裝結果已上傳至NCBI，注冊號JAJGRD000000000 (BioProject PRJNA776566)。

對米曲霉BL18和米曲霉3.042的共有及特有基因進行分析，首先對菌株的蛋白質基因集進行CD-HIT(v4.6.6)[14]聚類分析，將聚類的最終基因集作為Pan基因集。提取聚類結果中每個樣本共有的序列作為共有基因集。每個樣品中特有的基因集為特有基因集，Pan基因集中去除共有基因集和特有基因集為非必要基因集。

1.3 數據分析

采用Excel進行數據統計，實驗結果中的數據均為3個平行樣品均值，相對標準偏差在表和圖中分別以數值和誤差棒表示，采用Origin 2022作圖分析，顯著性分析由SPSS 19.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 制曲過程中的形態變化

將米曲霉BL18和米曲霉3.042在制曲過程中進行應用，并對制曲過程中曲塊表面米曲霉菌絲生長和產孢現象進行跟蹤觀察。如圖1所示，米曲霉BL18產孢提前8 h，在培養32 h時就能明顯觀察到菌絲與孢子產生，在培養40 h和48 h時曲塊產孢現象已經比較明顯。而接種米曲霉3.042的曲塊在制曲40 h時才開始出現明顯產孢，且在48 h和64 h成曲產孢程度明顯不如米曲霉BL18制備成曲。

圖1 制曲過程形態變化Fig.1 Morphological changes during koji making

2.2 制曲過程中孢子數的變化

進一步對米曲霉BL18和米曲霉3.042在制曲過程中的孢子數進行了測定。如圖2所示，在發酵前32 h米曲霉BL18和3.042的孢子數幾乎相同(P>0.05)。

圖2 制曲過程中的孢子數變化Fig.2 Changes in the number of spores during koji making

在制曲40～48 h時，米曲霉BL18制曲的孢子數開始上升，而米曲霉3.042的孢子數則幾乎不變。米曲霉BL18制備的曲樣品在48 h和64 h的孢子量分別為2.28×108個/g干曲和4.19×108個/g干曲，顯著高于(P<0.05)米曲霉3.042樣品孢子數(1.25×108個孢子/g干曲和2.89×108個孢子/g干曲)。上述結果說明米曲霉制曲過程的孢子數測定結果與制曲狀態觀察結果一致。豆瓣曲表面綠色孢子的形成是曲成熟的指標之一[15]，因此孢子形成速度越快，制曲時間越短。先前的研究還報道，米曲霉綠色孢子的形成伴隨著蛋白酶的產生和分泌[16]。具有更多孢子的曲樣品可能具有更高的蛋白酶活性。

2.3 制曲過程蛋白酶活力的變化

如圖3所示，米曲霉BL18和米曲霉3.042產生酸性蛋白酶的速率相似，而米曲霉BL18中性和堿性蛋白酶的分泌速率明顯快于米曲霉3.042。米曲霉BL18制曲樣品在培養64 h后的酸性、中性和堿性蛋白酶活性分別達到542.36、1 828.41、2 283.58 U/g，和米曲霉3.042制備的曲樣品(356.76、1 698.66、1 548.98 U/g)相比分別提高52%、7.6%和45.6%。米曲霉BL18制備的成曲總蛋白酶活性為4 654.35 U/g，比米曲霉3.042制備的成曲(3 604.40 U/g)提高29.1%。米曲霉在制曲過程發揮主要作用，米曲霉通過產生蛋白酶將原料中的蛋白質降解為寡肽和氨基酸，其生長和分泌蛋白酶的能力對成熟豆瓣曲的質量具有重要意義[17]，在豆瓣醬制曲過程中，首選蛋白酶活性較高的米曲霉，因為通過分解蛋白質產生的氨基酸和寡肽越多，豆瓣醬產品的質量可能會更好。

2.4 制曲過程中游離氨基酸的含量

取制曲時間為64 h樣品對17種游離氨基酸進行測定。如圖4所示，相比于米曲霉3.042，除了甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸外，其他13種氨基酸含量在米曲霉BL18所制曲中均有提升。其中天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分別提高了30.1%、8.9%、11.7%和1.2%；組氨酸、蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、賴氨酸分別提升了96.8%、83.6%、85.7%、114.1%、179.7%；游離氨基酸總量提升16.3%。游離氨基酸含量的提升依賴于蛋白質及多肽的降解，蛋白酶活力的高低將直接影響游離氨基酸產生，具有較高制曲酶活力的米曲霉BL18能有效提高多種氨基酸含量。

a-酸性蛋白酶；b-堿性蛋白酶；c-中性蛋白酶；d-總蛋白酶圖3 制曲過程蛋白酶活力的變化Fig.3 Changes of protease activity during koji making

圖4 制曲64 h游離氨基酸的含量Fig.4 Free amino acid content at 64 h of koji making

2.5 發酵過程中可滴定酸和pH的變化

可滴定酸通常是檢測發酵過程的一個重要參數，它的變化同微生物菌群的代謝情況有密切關系。在醬醅發酵的初始階段，由于高鹽環境的抑制作用，僅有少量的耐鹽微生物可以在其中生長繁殖，其中占優勢的主要是葡萄球菌屬及魏斯氏菌屬微生物。由于沒有其他微生物的競爭抑制，它們的數量快速增加，并產生大量的乳酸等有機酸，導致了醬醅發酵初期的pH值迅速下降(圖5-a)。隨著發酵過程的繼續，由于產酸的不斷積累，pH值下降到 5.5左右，而過低的pH值又抑制了產酸微生物(如葡萄球菌屬及魏斯氏菌屬)的生長，此時，一些可以耐高鹽和低pH值的酵母開始大量繁殖，并逐漸占優勢[18]。

米曲霉BL18和3.042醬醅可滴定酸含量在發酵過程迅速積累(圖5-b)。米曲霉BL18可滴定酸從0.64 g/100 g增加到了1.63 g/100 g，pH則從6.21下降到了5.81。米曲霉3.042可滴定酸從0.51 g/100 g增加到了1.63 g/100 g，pH則從6.22下降到了5.87。制曲過程米曲霉BL18具有更高的蛋白酶活力，高蛋白酶活力可使原料更充分地降解，使成曲氨基酸及寡肽等營養物質含量提高，這些營養物質為發酵初始階段產酸微生物提供了快速增長條件，從而造成產酸以及pH等指標差異。

a-pH;b-可滴定酸圖5 發酵過程pH及可滴定酸的變化Fig.5 Titratable acid and pH changes during fermentation

2.6 發酵過程中蛋白酶活力的變化

蛋白酶的活力和穩定性對豆瓣醬的原料利用率和品質有著重要的作用。豆瓣醬醅屬于一種極端的生理環境，具有高鹽度和低pH的特點[19]。蛋白酶的活力在其中會受到高鹽度的抑制，從而導致發酵周期的延長，低 pH 值則會影響到蛋白酶的穩定性。如圖6所示，醬醅蛋白酶活力在發酵過程呈現先上升后下降趨勢，中性和堿性蛋白酶活力在發酵第7天達到峰值，然后呈現下降趨勢；米曲霉BL18成曲所制醬醅發酵過程酸性蛋白酶活力在第28天達到最大，而米曲霉3.042則在第35天達到最大。米曲霉BL18成曲所制醬醅酸性、堿性及中性蛋白酶活力在發酵前28天均高于米曲霉3.042。以上結果說明米曲霉BL18發酵豆瓣醬在發酵前期的蛋白酶具有優勢。之前的研究表明米曲霉在加入鹽水發酵后生長受到抑制，在發酵前期逐漸消亡[20]，但是米曲霉分泌的許多蛋白酶都具有一定的耐鹽性，仍然能夠繼續在高鹽醬醅體系里發揮作用，研究表明耐鹽米曲霉蛋白酶在發酵相同時間后剩余蛋白酶活力更高，使發酵成品氨基酸及風味物質含量得到提升[21]。發酵前期，米曲霉BL18成曲所制醬醅蛋白酶活力優于米曲霉3.042，可能與它分泌的蛋白酶耐鹽性具有一定關系，同時也有助于豆瓣醬品質提升。另一方面米曲霉BL18更高的蛋白酶活力能產生更豐富的寡肽氨基酸等營養物質，這些營養物質為其他產蛋白酶微生物如芽胞桿菌等的生長提供了條件[18]。

a-酸性蛋白酶；b-堿性蛋白酶；c-中性蛋白酶；d-總蛋白酶圖6 發酵過程蛋白酶活力的變化Fig.6 Changes of protease activity during fermentation

2.7 發酵過程中氨基酸態氮的變化

氨基態氮是衡量豆瓣醬品質的一個重要指標，它的含量同蛋白酶活力有著密切關系。如圖7所示，發酵前21天，米曲霉BL18醬醅的氨基酸態氮迅速積累，從開始的0.27 g/100 g增加到了0.90 g/100 g，米曲霉3.042則從0.27 g/100 g增加到了0.84 g/100 g。之后增速放緩，發酵結束時，氨基酸態氮含量分別達到1.03 g/100 g和0.99 g/100 g。氨基酸態氮含量變化與蛋白酶活力變化相反，發酵28 d后，酸性、中性和堿性蛋白酶活力都呈現下降趨勢，而氨基酸態氮增速恰好放緩，這說明氨基態氮的產生主要集中在發酵前期，這與CHOU等[22]的研究一致，且和蛋白酶的逐漸失活密切相關。

圖7 發酵過程氨基酸態氮含量的變化Fig.7 Changes of amino acid nitrogen content during fermentation

2.8 發酵結束的游離氨基酸含量

食物的口感主要由低分子質量物質和非揮發性物質所決定?？谖锻ǔ７?種，即甜味、苦味、咸味、酸味和鮮味[23]。豆瓣醬中的游離氨基酸主要是由多肽的進一步降解而產生，對豆瓣醬口感的形成具有重要的作用。不同的氨基酸可以提供不同的口味，谷氨酸具有強烈的鮮味，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸具有甜味，而纈氨酸、苯丙氨酸和組氨酸具有苦味。如圖8所示，相比于米曲霉3.042豆瓣樣品，米曲霉BL18豆瓣樣品中的鮮味氨基酸、甜味氨基酸總量分別提升33.3%和10.8%，必需氨基酸、苦味氨基酸總量略有提升(8.1%、9.4%)，鮮味及甜味氨基酸的提升可能有助于提高豆瓣醬鮮甜口感。以上結果表明米曲霉BL18發酵的豆瓣醬在氨基酸組成方面優于3.042。

a-鮮味氨基酸；b-甜味氨基酸；c-苦味氨基酸；d-必需氨基酸圖8 發酵56 d游離氨基酸含量Fig.8 Free amino acid content at day 56 of fermentation

2.9 米曲霉BL18基因組測序結果

為進一步分析米曲霉BL18遺傳信息，挖掘其具有優良發酵性能的分子基礎，對米曲霉BL18進行全基因組測序?；蚪M組裝結果如表1及圖9-a顯示。

表1 米曲霉BL18基因統計Table 1 Aspergillus oryzae BL18 gene statistics

米曲霉BL18基因組共有9個Scaffold、17個Contig，全長38 438 172 bp，GC含量為47.18%。編碼蛋白基因共13 251個，占全基因組長度的49.38%；外顯子數41 555，占全基因組長度的49.38%；內含子數28 304，占全基因組長度的5.73%。米曲霉3.042則預測到11 379個基因，外顯子區總長度為44%[24]，基因數量和外顯子長度比例的差異，一方面是測序技術和分析手段的進步引起的，另一方面也體現了米曲霉BL18優勢釀造性能的分子基礎。

對米曲霉 BL18 基因組注釋的基因進行 KOG 功能注釋(圖10)，其中以下功能類群富集了大量功能基因：氨基酸的運輸與代謝(Amino acid transport and metabolism)、能量生產與轉換(Energy production and conversion)、脂肪運輸與代謝(Lipid transport and metabolism)、糖運輸與代謝(Carbohydrate transport and metabolism)、次級代謝(Secondary metabolisms biosynthesis，transport and catabolism)、翻譯、核糖體結構和生物發生(Translation, ribosomal structure and biogenesis)、輔酶運輸和代謝(Coenzyme transport and metabolism)、翻譯后修飾(Posttranslational modification，protein turnover, chaperones)。大量功能基因的富集，表明米曲霉具有強大的能量合成能力、蛋白質合成及轉運的能力，這是其在發酵工業廣泛應用的遺傳基礎[25]。類群次級代謝富集大量基因，表明米曲霉具有較強的次級代謝產物合成能力，這為米曲霉產生多種多樣的風味功能物質提供了可能。

a-米曲霉BL18基因組圈圖；b-米曲霉BL18特有基因注釋結果；c-米曲霉3.042特有基因注釋結果圖9 米曲霉BL18基因組及特有基因注釋信息Fig.9 A. oryzae BL18 genome and unique gene annotation information

圖10 米曲霉BL18基因KOG功能注釋Fig.10 A. oryzae BL18 gene KOG annotation results

對米曲霉BL18基因組注釋的基因進行KEGG途徑分析(圖11)，以下途徑富集了大量功能基因：碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、運輸和分解代謝(Transport and catabolism)、翻譯(Translation)、脂質代謝(Lipid metabolism)、信號轉導(Signal transduction)、折疊、排序與降解(Folding, sorting and degradation)、能量代謝(Energy metabolism)。這與KOG功能富集分析的結果是一致的，說明米曲霉BL18在碳代謝(與生長相關)、蛋白質合成、能量代謝方面具有遺傳優勢。此前關于米曲霉釀造模式菌株RIB40轉錄組研究的結果表明，與能量代謝、蛋白質合成等相關的基因在固體發酵條件下具有高的轉錄表達水平[26]，也說明米曲霉在基因組上與能量代謝、蛋白質合成相關優勢也能體現在實際的發酵應用中。

圖11 米曲霉BL18基因的KEGG代謝途徑注釋Fig.11 KEGG pathway analysis of annotated genes in the genome of A. oryzae BL18

同時分析比較了米曲霉 BL18和米曲霉3.042的基因序列，共同擁有的基因為共有基因(多數為菌株生長必須基因)，而某個樣品所特有的基因稱為這個樣品的特有基因。共有基因和特有基因的研究對不同樣品基因組的功能差異性和相似性的研究有重要作用，為物種表型的相似性和差異性的研究提供分子依據。2株米曲霉共有基因為4 359個，米曲霉BL18中有647個特有基因，而米曲霉3.042僅為57個。進一步對特有基因在COG數據庫進行注釋，結果如圖9-b及圖9-c所示，米曲霉BL18注釋到11個基因，而米曲霉3.042只注釋到5個基因，而且米曲霉BL18特有基因注釋到氨基酸轉運及代謝、能量產生和轉化以及脂質轉運及代謝功能。

3 結論

本研究通過對米曲霉BL18進行豆瓣醬的制曲發酵，并對常規理化指標進行跟蹤，發現米曲霉BL18在豆瓣醬的生產過程具有優勢性能，同時對優勢性能的分子基礎進行了初步探究。在豆瓣醬制曲過程，米曲霉BL18能有效提高制曲過程孢子數以及成曲蛋白酶活力，米曲霉BL18成曲的孢子數達到4.19×108個/g干曲，酸性、中性和堿性蛋白酶活力分別提高52%、7.6%和45.6%。13種游離氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸等含量也有所提高。米曲霉BL18蛋白酶在豆瓣醬發酵前期具有優勢，由于可滴定酸的迅速增加，醬醅的pH值快速下降，導致蛋白酶活力的下降，氨基酸態氮的生成主要集中在發酵初期。對發酵后的豆瓣醬游離氨基酸進行分析，發現米曲霉BL18豆瓣樣品中的鮮味氨基酸、甜味氨基酸總量分別提升33.3%和10.8%。與米曲霉3.042進行比較，發現從制曲過程蛋白酶的活力、孢子產生速率及數量、發酵豆瓣醬的蛋白酶活力及氨基酸組成等方面，米曲霉BL18均優于對照組。米曲霉BL18基因KOG和KEGG數據庫注釋結果表明米曲霉 BL18具有強大的能量合成、蛋白質合成及次級代謝產物合成能力。分析米曲霉BL18和3.042共性基因與特性基因時，發現米曲霉BL18中有647個特有基因，而米曲霉3.042僅為57個，特有基因功能集中在氨基酸轉運及代謝、能量產生和轉化以及脂質轉運及代謝功能。米曲霉BL18在制曲發酵過程表現出的優勢性能及大量功能基因的注釋為其在豆瓣醬發酵應用中提供了理論基礎。