八種精油對乳酸菌及致病菌的選擇抑制性篩選及其應用研究

薛元泰，吳世芳，李義恒，石承瑞，楊曉麗，魯迎瑞，王瑩，張衛兵*，文鵬程*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省商業科技研究所有限公司，甘肅 蘭州，730010)3(武威高原生物制品有限責任公司，甘肅 武威，733000)

發酵乳作為益生菌的載體，在全世界被廣泛消費。為了滿足和豐富對發酵乳的偏好及提高產量，人們開始添加各種營養及功能成分[1]。植物精油(狹葉精油[2]，留蘭香、水薄荷精油[3]，肉桂、丁香、迷迭香等精油[4]，蒔蘿精油[5]，紫蘇葉精油[6]等)因為良好的功能性及益生性也被國內外學者添加于發酵乳中并進行研究。

精油是自植物中提取的天然產物，被美國食品藥物管理局認定為一般認定為安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的物質，在食品行業具有廣泛的應用前景。大多數精油對病原菌具有抑制作用，且抑菌途徑涉及細胞的細胞壁、細胞膜、細胞質等方面，菌種對精油難以產生耐藥性[7]，精油能為發酵乳的食用創造一層安全保障。另一方面，精油抑制病原菌的同時，也可能對發酵菌種產生影響，而較致病菌而言，乳酸菌是對精油不敏感的微生物[3]。在發酵乳中致病菌引發的中毒事件時有報道[1]，開發新型綠色的抑菌劑迫在眉睫。目前針對單種精油對乳源微生物作用及多種精油對致病菌的抑菌效果研究較多，而各種精油對致病菌及乳酸菌的選擇抑制性報道較少。

本試驗預選8種精油，以抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為表征，分析精油對6株乳酸菌及2株致病菌的抑菌活性，從中篩選出具有強抑制作用及選擇抑制性的精油，并系統研究pH對MIC的影響，旨在為發酵產品篩選合適的植物精油提供一定理論基礎；以OD600值表征所篩選的精油各濃度對指示菌的生長過程的影響，并制作精油發酵乳，對發酵及儲藏過程活菌數、pH、滴定酸度等指標進行監測，探究其在發酵乳中的實際作用，為精油應用于發酵乳提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料

肉桂、牛至、百里香、羅勒、沒藥、丁香，市售；留蘭香，安徽桑標貿易有限公司；迷迭香，洛陽迷迭香農業開發有限公司；乳酸鏈球菌素(Nisin)，索萊寶公司；其他試劑均為分析純。

嗜酸乳桿菌G1、鼠李糖乳桿菌G5、羅伊氏乳桿菌G8、副干酪乳桿菌L9、嗜熱鏈球菌Q1、嗜熱鏈球菌Q2由甘肅農業大學食品科學與工程學院功能乳品工程實驗室分離鑒定并保存；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)由甘肅農業大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供并保存。乳酸菌的培養采用MRS肉湯及MRS固體培養基，致病菌采用TSB和TSA培養基。

1.1.2 儀器與設備

Versa Max全波長酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；pH S-3C精密pH計、HG 303-4電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；游標卡尺，上海九金工具有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油的提取

采用水蒸餾法提取精油。粉碎后的物料與蒸餾水以料液比1∶10(g∶mL)混合，采用Clevenger裝置蒸餾4 h，收集后于4 ℃暗光保存。

1.2.2 菌種的活化

菌種在甘油管中于-80 ℃保存。使用前，將指示菌活化3代(37 ℃，12 h)，調節菌液濃度，備用。

1.2.3 抑菌圈直徑的測定

參照文獻[7]的方法。將100 μL 108CFU/mL的菌液涂布于培養基，將濾紙片貼于其上，移取5 μL精油或10 mg/mL的Nisin水溶液于濾紙片上，37 ℃培養24 h，十字交叉法測定抑菌圈大小并記錄。

1.2.4 MIC的測定

根據歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會[8]的建議。用濃鹽酸調整液體培養基的初始pH為6.4、5.8、5.2、4.6、4.0，滅菌，并加入0.5%(體積分數)的二甲基亞砜(過0.22 μm濾膜)。在96孔板前11列完成精油濃度為20 μL/mL到0.156 μL/mL的稀釋，第12列為不加精油的生長對照，每孔100 μL。再接入100 μL 106CFU/mL菌液，吹打混勻。37 ℃培養24 h，未觀察到可見微生物生長的最低濃度為精油的MIC。

1.2.5 生長曲線

參照陳默等[9]的方法。將100 μL 108CFU/mL的菌液加到100 mL含不同濃度牛至精油的培養基(含1.5%甘油作為乳化劑)中，混勻。吸取250 μL上述培養基于96孔板中，以不含精油的培養基為生長對照(CK)，以不含菌的培養基為參比，37 ℃培養48 h，每隔一段時間用酶標儀在600 nm處測定吸光值。

1.2.6 發酵乳制備

配制脫脂乳粉質量分數為12%的復原乳，加入1.5%(體積分數)吐溫-80為乳化劑，均質。95 ℃滅菌5 min，冷卻至40 ℃，無菌條件下，加入0、0.156、0.313 μL/mL的牛至精油，以2%(體積分數)的接種量接種產酸能力最強的G5菌液，混勻，42 ℃培養，每隔0.5 h觀察并記錄凝乳時間，每隔4 h測定活菌數、pH及滴定酸度。將凝乳的發酵乳放入4 ℃后熟，在1、7、14、21、28 d時測定活菌數、pH、滴定酸度、DPPH自由基清除率。

1.2.7 活菌數測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定活菌數。

1.2.8 pH和滴定酸度的測定

pH用精密pH計測定。參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》測定酸度。

1.2.9 DPPH自由基清除率

參照李思寧等[10]的方法并略作修改。將樣品于4 ℃、8 000×g離心10 min，收集上清液，過0.45 μm濾膜，獲得乳清樣品。將2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L，95%甲醇作為溶劑)與1 mL的乳清樣品或95%甲醇(對照)混勻，反應20 min。4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液，于517 nm測定吸光值為A2。用95%甲醇代替DPPH溶液測定吸光值為A1。用1 mL蒸餾水代替待測樣品測定吸光值為A0。DPPH自由基清除率按公式(1)計算：

(1)

1.2.10 感官評價

參考羅惠等[11]的方法并略作修改。由10名經過培訓的人員按照表1對后熟1 d的發酵乳進行評價。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards

1.2.11 統計分析

所有試驗均重復3次，采用Excel進行數據統計。使用SPSS 19.0的單因素方差分析中的鄧肯氏多重比較進行顯著性差異分析，以P<0.05為差異顯著。利用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈直徑

菌種對精油敏感程度判定標準為：直徑≤12 mm為低度敏感，12 mm<直徑≤20 mm為中度敏感，直徑>20 mm為高度敏感[7]。抑菌劑對指示菌的抑菌圈大小如表2及圖1所示。精油對乳酸菌的抑菌圈直徑均顯著小于致病菌(P<0.05)。類似的結論也被AMBROSIO等[12]報道。乳酸菌對牛至、肉桂精油均中度敏感，而致病菌為高度敏感，2種精油展現了最好的抑菌效果。牛至精油的選擇抑菌性更強，其對致病菌的抑菌圈直徑均顯著高于肉桂精油(P<0.05)，而其抑制G8 (17.88±0.53) mm、L9 (18.44±0.98) mm的能力顯著低于肉桂精油G8 (20.79±0.99)、L9 (20.41±0.06) mm(P<0.05)。FANCELLO等[13]研究也指出肉桂精油在各精油中抑制乳酸菌的能力最強。乳酸菌和E.coli對百里香中度敏感，S.aureus為高度敏感，乳酸菌和致病菌分別對丁香呈現低度敏感和中度敏感，兩者抑菌性弱于牛至、肉桂。致病菌對迷迭香、羅勒、沒藥、留蘭香精油均低度敏感，作為抑菌劑的能力較弱。按照精油抑制致病菌的程度從強到弱排序分別為牛至>肉桂>百里香>丁香，抑制乳酸菌程度從強到弱排序為肉桂=牛至>百里香>丁香。

表2 K-B法抑菌結果 單位：mm

圖1 部分抑菌劑對指示菌的生長的影響Fig.1 Effect of some bacteriostatic agents on the growth of bacterial

本文以Nisin為陽性對照。結果顯示，Nisin水溶液抑制乳酸菌(Q2除外)效果均顯著強于致病菌(P<0.05)，賀松等[14]也有一致的研究結果。抗菌物質對致病菌及益生菌的選擇抑制性是確定其抗菌譜的重要特征[15]，牛至、肉桂、百里香、丁香精油在該方面展現出較Nisin更好的性能，故以這4種精油作為MIC試驗展開的對象。

2.2 MIC

通常將pH 4.0作為發酵乳的貨架期終點[6]，故對精油進行pH 6.4～4.0下的MIC試驗，結果如表3所示。精油對乳酸菌的MIC隨著pH的降低均降低。這說明一定濃度的精油在乳酸菌發酵過程中具有前期影響小，后期抑制乳酸菌生長的潛力，這將有利于控制乳酸菌過度繁殖導致的后酸化。當pH為4.6和4.0時，E.coli和S.aureus依次不生長，根據ARYANA等[1]的報道，致病菌會在高pH下生長、低pH下進行變異，因而可能存在于低pH食品中。添加精油可以有效抑制高pH下致病菌生長，同時減小其在低pH下變異的風險。

表3 精油在不同初始pH環境下MIC的測定結果Table 3 MIC of essential oils in different initial pH environments

相同pH下，牛至、肉桂、百里香、丁香精油對致病菌的MIC遠小于對乳酸菌的MIC，這些精油均具有作為發酵制品抗菌劑的潛力。牛至精油具有最低的MIC，使用時可減少用量，從而減小對產品風味及品質的影響，其對乳酸菌的MIC(0.625～2.5 μL/mL)遠大于對致病菌的(0.156～0.313 μL/mL)，故進一步研究牛至精油濃度(0.156～2.5 μL/mL)對指示菌生長情況的影響，試驗采用GC-MS對牛至精油進行成分表征，成分主要為香芹酚51.78%(數據未展示)。

2.3 生長曲線

圖2監測了指示菌在不同濃度的牛至精油處理下的生長情況，精油通過抑制細菌對數期的正常分裂和繁殖，使其無法達到正常的生長高峰，這與薩仁高娃[7]的研究一致。精油含量0.156 μL/mL時便已完全抑制E.coli的生長(圖2-h)和有效抑制S.aureus的生長(圖2-g，生長量僅為CK的51.06%)，而乳酸菌的生長量可達CK的95.26%～104.57%(圖2-a～圖2-f)。精油含量0.313 μL/mL時完全抑制S.aureus、E.coli的生長(圖2-g～圖2-h)，乳酸菌的生長量達到CK的91.54%～102.12%(圖2-a～圖2-f)。精油含量0.625 μL/mL時，各乳酸菌的生長量為CK的62.76%～87.94%，更高濃度下乳酸菌不生長(圖2-a～圖2-f)。結果表明，0.156、0.313 μL/mL牛至精油可作為發酵制品抑菌劑來抑制致病菌的生長，且不會對乳酸菌造成明顯的影響。

2.4 牛至精油對乳酸菌發酵過程的影響

2.4.1 凝乳時間及活菌數

各組均在16.5 h凝乳，精油未對凝乳時間造成影響。各組發酵乳發酵過程中活菌數如表4所示。在凝乳時間內，即16.5 h前，精油組與CK間無顯著性差異(P>0.05)。20 h時，精油組活菌數均顯著高于CK(P<0.05)，且有劑量關系，這可能因為精油具有抗氧化性，可以清除O2為益生菌生長提供合適的條件[16]。24 h時，精油組活菌數均顯著低于CK(P<0.05)，這可能與過酸環境下精油的抑菌性加強有關[17]。

a-G1；b-G5；c-G8；d-L9；e-Q1；f-Q2；g-S.aureus；h-E.coli圖2 不同濃度的牛至精油對細菌生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of oregano essential oil on bacterial growth注：數字為48 h時該處理組生長量占CK生長量的百分比

表4 牛至精油對發酵乳活菌數的影響單位：lg CFU/mL

2.4.2 產酸特性

各組發酵乳發酵過程中pH和酸度如圖3所示。凝乳前，第16 h時，牛至精油對發酵乳pH無顯著影響，對滴定酸度具有顯著促進作用，值得注意的是，在12 h內，精油組的滴定酸度顯著低于CK(P<0.05)，這可能因為精油中游離的羥基離子會中和乳酸菌產生的乳酸[18]。發酵20 h，0.313 μL/mL組pH顯著低于其余組，精油組滴定酸度顯著高于CK(P<0.05)，精油對乳酸菌產酸呈現促進作用。發酵24 h，0.313 μL/mL組pH顯著高于其余組，精油組滴定酸度顯著低于CK(P<0.05)，這說明精油在低pH高酸度條件下顯著抑制了乳酸菌的產酸。鄭佳[6]利用紫蘇葉精油也成功延緩了發酵乳儲藏中的后酸化現象。綜上，牛至精油對乳酸菌產酸呈現促進-抑制的趨勢，且濃度增加會增大該趨勢。

a-pH；b-滴定酸度圖3 牛至精油對乳酸菌產酸特性的影響Fig.3 Effects of oregano essential oils on the acid-producing properties of lactic acid bacteria

2.5 牛至精油對發酵乳儲藏過程的影響

2.5.1 活菌數

牛至精油對發酵乳儲藏過程中活菌數的影響結果如表5所示。活菌數在7 d時增長至最高，后呈現下降的趨勢。精油組活菌數均高于CK，0.313 μL/mL組在儲藏期均顯著高于CK(P<0.05)。MEHDIZADEH等[5]報道，蒔蘿精油提高了儲藏至14 d時發酵乳中益生菌的數量及活力。本研究表明，0.156～0.313 μL/mL的牛至精油在儲藏期均有效提高了發酵乳活菌數，牛至精油0.313 μL/mL時活菌數最高。

表5 牛至精油對發酵乳儲藏過程活菌數的影響 單位：lg CFU/mL

2.5.2 產酸特性

發酵乳儲藏28 d的pH及滴定酸度結果如圖4所示。在7 d內，0.313 μL/mL組的pH顯著低于CK，精油組的酸度均顯著高于CK(P<0.05)，精油促進了乳酸菌的產酸，且有劑量依賴性。14～28 d時，精油組的pH與酸度均和CK無顯著性差異(P>0.05)。MEHDIZADEH等[5]也有相似的報道。研究表明，牛至精油在儲藏7 d內對pH及滴定酸度均有顯著的促進作用。

a-pH；b-滴定酸度圖4 牛至精油對儲藏過程中乳酸菌產酸特性的影響Fig.4 Effects of oregano essential oils on acid production characteristics of lactic acid bacteria during storage

2.5.3 抗氧化性

牛至精油添加對發酵乳DPPH自由基清除能力的影響如圖5所示。在每個監測時間點，精油組DPPH自由基清除能力均顯著高于空白組(P<0.05)，且呈現劑量關系。JOUNG等[19]的研究中也有相似結果。這可能是由于牛至精油具有良好的抗氧化性，其中存在的酚類等成分發揮了作用，使得自由基清除率升高[20]。

圖5 牛至精油對發酵乳清除DPPH自由基能力的影響Fig.5 Effects of oregano essential oils on DPPH free radical scavenging rate of fermented milk

2.6 牛至精油對發酵乳感官評價的影響

發酵乳感官評分如圖6所示。精油對發酵乳的色澤影響不大，樣品均呈現乳白色。精油具有特有的風味，造成了氣味、滋味評分的降低，且隨濃度的增加而降低。精油對質構的影響并無劑量依賴性，0.156 μL/mL組乳清析出較多，評分較低，0.313 μL/mL組與CK評分相近。ELAMA等[4]報道，添加250 μL/kg的肉桂、丁香和迷迭香精油可賦予發酵乳制品良好的抑菌性，但同時精油帶來了感官評價小組中一些成員不喜歡的強烈風味，這與本試驗結果一致。而JOUNG等[19]報道，0.2%(質量分數)的柿子葉和蓮葉提取物改善了發酵乳的口感和質地。MAHMOUDI等[2]報道，不同濃度的精油雖然都引起了發酵乳感官特性的降低，但低劑量仍可以得到較好的接受度。本試驗表明，0.156、0.313 μL/mL的牛至精油引起了發酵乳氣味、滋味、質構和總體接受度的下降。

圖6 牛至精油對發酵乳感官評價的影響Fig.6 Effects of oregano essential oils on sensory evaluation of fermented milk

3 結論

結果表明，牛至、肉桂、百里香、丁香精油具有良好的選擇抑制性，對致病菌S.aureus和E.coli的抑制能力顯著強于乳酸菌，精油表現出較Nisin(對照)更具作為發酵產品抗菌劑的潛力。4種精油對指示菌的MIC隨pH的降低而降低。0.156、0.313 μL/mL的牛至精油對培養基中乳酸菌的生長基本無影響，但具有完全抑制或部分抑制致病菌生長的能力。本文驗證了0.156、0.313 μL/mL的牛至精油作為發酵乳添加劑的可行性。在發酵過程中，牛至精油對發酵乳凝乳時間、活菌數基本無影響，有助于乳酸菌在凝乳期的產酸，在過發酵情況下，精油有助于控制后酸化。在儲藏過程中，精油處理使得7 d內活菌數顯著增加，酸度提高，并增強了抗氧化能力，但造成氣味、滋味、質構和總體接受度的下降。